三维肿瘤生物模型的创建[肿瘤咨询在线论坛]

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三维肿瘤生物模型的创建

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<p align="center"><strong>三维肿瘤生物模型的创建 </strong><strong></strong><p align="center">—— 从体外肿瘤生物学研究到临床应用 <p align="center">  <p align="center">上海瑞金医院集团闵行医院刘华杨炜   <strong>【摘要】 </strong>本文揭示一种在体外构建肿瘤的方法以及采用所述方法获得的体外肿瘤生物模型。所述方法包括将肿瘤细胞置于我们发明的三维细胞培养单元中，使肿瘤细胞生长并在体外构建实体肿瘤。本方法为肿瘤细胞提供了近似于体内生长和运动的理想的三维环境。首次实现在离体条件下构建肿瘤。所构建的肿瘤具有和体内恶性肿瘤相似的细胞生物学特性并可分泌肿瘤相关抗原。所述方法可随时动态观察肿瘤细胞和肿瘤的生长、分化、移行、运动、浸润、转移或凋亡等特性。所述体外肿瘤模型为癌症的研究提供了独特的环境，可实施各种针对特定肿瘤的基础和临床研究。对肿瘤的指导预防、辅助诊断、改进治疗和评估预后等方面的研究将提供宝贵的作用。 <strong>【关键词】 </strong>肿瘤生物学；转移和浸润；三维肿瘤生物模型   肿瘤占世界和我国人口死亡率第二位。为攻克肿瘤，许多发达国家花费巨额资金和大量人力进行研究，但目前每年全世界至少有 700 万人死于癌症，其中我国约 130 万。因此癌症的防治与研究具有十分重要的意义 [1] 。肿瘤的体外研究主要依靠二维培养各种肿瘤细胞系或株或原代肿瘤细胞来进行，但其结果并不能真正反映呈三维状态生长的肿瘤。为了克服肿瘤单层细胞培养的缺点，有些研究者采用了多细胞的圆球体作为体外肿瘤模型 [2] 。但由于只有部分肿瘤细胞株可以在培养条件下自发性的生长形成肿瘤圆球体，肿瘤多细胞圆球体要依靠低速度的离心力，持续旋转的培养皿，或者是借助于培养液中的化学物质才能形成。所以肿瘤多细胞圆球体并不是一个真正的肿瘤的自然聚积生长过程。另外多细胞的肿瘤圆球体模型也很难直接用于肿瘤的侵袭和转移的研究。另一可供选择的方法是将肿瘤细胞株接种到裸鼠中，观测其三维组织结构的形态和功能。裸鼠动物实验成本较高，耗时较长，受影响因素较多，而且不利于连续动态观察。这使其应用价值受到了一定的限制。肿瘤的浸润和转移是恶性肿瘤的生物学特征之一。临床肿瘤转移的发生率相当高，据统计 60% 以上的恶性肿瘤患者于初次诊断时已发现有转移。肿瘤侵袭和转移是肿瘤发生和演进过程中最危险阶段。肿瘤患者约有 80% 以上死于侵袭和转移。因此肿瘤转移是一个十分令人关注的临床治疗的难题。目前，很难直接从哺乳动物体内观察到恶性肿瘤的浸润和转移的全过程。动物的自发性肿瘤在短期内出现转移的也不多。因此，迫切需要开发一种具与哺乳动物体内的肿瘤有相同特性的、可方便地用于肿瘤浸润和转移研究以及药物筛选的体外实体肿瘤模型。   一、材料与方法   所用肿瘤细胞株均来源于人类：肝癌细胞株 SMMC 7721 ，肝癌细胞株 ATCC HB-8065 ，结肠癌细胞株 ATCC CCL-209 ，卵巢癌细胞株 ATCC HTB-161 ，乳腺癌细胞株 ATCC HTB-22 ，小细胞肺癌细胞株 ATCC HTB-171 。采用本装置培养肿瘤细胞之前将肿瘤细胞按照通常的方法培养至细胞长满到 80% ～ 90% 时消化，消化后的肿瘤细胞置于三维细胞培养单元中，再将其放入所需的液体培养基中，然后放于常规的二氧化碳培养箱中培养，使肿瘤细胞生长形成肿瘤。为观察化学治疗药物的作用，我们将结肠癌细胞株 (LOVO, ATCC CCL-229) 置于三维细胞培养单元中，使肿瘤细胞生长形成肿瘤。然后将化学治疗药物乐沙定直接放入所述的结肠癌模型的培养基中， 48 小时后比较在使用化学治疗药物前后肿瘤细胞的生长状况。同时测定细胞培养液中的癌胚抗原的浓度变化。未加入乐沙定的结肠癌模型作为对照。   二、结果   体外培养所获得的肿瘤生物模型具有与体内恶性肿瘤相似的生物学和细胞学特性。培养装置中的恶性肿瘤细胞可形成类似于原位癌的微小癌。所形成的恶性肿瘤具有和体内恶性肿瘤相似的生长状态和细胞生物学特性。表现为肿瘤细胞的快速生长、呈无限制性增生、早期出现中央性坏死、肿瘤的结构包含有一个活跃增生的外层细胞以及一个较为松散含有许多死亡的和正在死亡细胞的中央。 ( 图 1A-B) <p align="center"><img height="173" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image021.jpg" width="276" alt=""/><img height="172" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image022.jpg" width="264" alt=""/>A B <p align="center">图 1 <p align="center">图 1A 结肠癌细胞株， 1B 肝癌细胞株 8065 。体外培养所获得的肿瘤生物模型具有与体内恶性肿瘤相似的生物学和细胞学特性。表现为肿瘤细胞的快速生长、早期出现中央性坏死、肿瘤的结构包含有一个活跃增生的外层细胞以及一个较为松散含有许多死亡的和正在死亡细胞的中央。放大倍数为 20× 在显微镜下可观察到；各种肿瘤有与其来源类似的特性。如小细胞性肺癌呈圆球形，结肠癌表现为菜花状或不规则结节。更重要的是，这一体外肿瘤模型处于生长和功能活性状态达几个月之久。而且可以分泌与临床观察所一致的肿瘤相关抗原，如肝癌分泌 AFP ，结肠癌分泌癌胚抗原，和卵巢癌分泌癌抗原 125 。 ( 图 2A-D, 图 3)   <table cellspacing="0" cellpadding="0" align="center"><tbody><tr><td valign="top" width="148"><img height="93" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image023.jpg" width="132" alt=""/></td><td valign="top" width="148"><img height="92" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image024.jpg" width="129" alt=""/></td><td valign="top" width="148"><img height="95" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image025.jpg" width="130" alt=""/></td><td valign="top" width="148"><img height="92" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image026.jpg" width="130" alt=""/></td></tr></tbody></table>A B C D <p align="center">图 2 <p align="center">图 2A 小细胞肺癌细胞株， 2B 结肠癌细胞株， 2C 卵巢癌细胞株， 2D 肝癌细胞株 7721 。各种肿瘤有与其来源类似的特性。如小细胞性肺癌呈圆球形，结肠癌表现为菜花状或不规则结节。放大倍数依次为 20×10×40×10×     <p align="center"><img height="328" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image027.gif" width="547" alt=""/><p align="center">图 3   在显微镜下还可观察到；细胞有微绒毛和足突的形成、包括叶状和丝状伪足；还可观察到所构建的肿瘤的浸润和转移，如细胞的播散和种植、穿透性浸润、运动和 / 或脱落至肿瘤周围。 ( 图 4A-D)         <table cellspacing="0" cellpadding="0" align="center"><tbody><tr><td valign="top" width="152"><img height="103" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image028.jpg" width="132" alt=""/></td><td valign="top" width="150"><img height="100" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image029.jpg" width="130" alt=""/></td><td valign="top" width="150"><img height="98" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image030.jpg" width="129" alt=""/></td><td valign="top" width="138"><img height="97" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image031.jpg" width="130" alt=""/></td></tr></tbody></table>A B C D <p align="center">图 4 <p align="center">图 4A 小细胞肺癌细胞株， 4B 肝癌细胞株 7721 ， 4C 结肠癌细胞株， 4D 卵巢癌细胞株。在显微镜下可观察到；细胞有微绒毛和足突的形成、包括叶状和丝状伪足；可观察到肿瘤的浸润和转移，如细胞的播散和种植、穿透性浸润、运动和 / 或脱落至肿瘤周围。放大倍数依次为 4 0 × 4 0 × 1 0 × 4 0 ×   不同类型的肿瘤有不同的生物学特性。如其发生侵袭和转移的时间、频率和程度等的不同。如肝癌细胞株 7721 发生侵袭和转移的时间早、其频率和程度均明显大于乳腺癌细胞株 22 。可见细胞脱离母体肿瘤向周边和远处转移、黏附于基质并呈克隆性生长形成多发性转移性肿瘤。有时可见大量细胞脱离母体肿瘤向周边和远处转移，呈克隆性生长并形成多个继发性肿瘤。 ( 图 5A-B)   <table cellspacing="0" cellpadding="0" align="center"><tbody><tr><td valign="top" width="247"><img height="178" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image032.jpg" width="237" alt=""/></td><td valign="top" width="280"><img height="179" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image033.jpg" width="266" alt=""/></td></tr></tbody></table>A B <p align="center">图 5 <p align="center">图 5A 乳腺癌细胞株， 5B 肝癌细胞株 7721 。不同类型的肿瘤有不同的生物学特性。肝癌细胞株 7721 发生侵袭和转移的时间早、频率和程度均明显大于乳腺癌细胞株 22 。可见细胞脱离母体肿瘤向周边和远处转移、黏附于基质并呈克隆性生长形成多发性转移性肿瘤。放大倍数为 2 0 × 。   不同类型的肿瘤亦表现出明显不同程度的细胞凋亡。在我们所观察的肿瘤细胞模型中，卵巢癌发生细胞凋亡的程度最为显著。 ( 图 6A-B) <table cellspacing="0" cellpadding="0" align="center"><tbody><tr><td valign="top" width="235"><img height="162" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image034.jpg" width="255" alt=""/></td><td valign="top" width="242"><img height="162" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image035.jpg" width="263" alt=""/></td></tr></tbody></table>A B <p align="center">图 6 <p align="center">图 6A 乳腺癌细胞株， 5B 卵巢癌细胞株。在我们所观察的肿瘤细胞模型中，卵巢癌 161 发生细胞凋亡的程度最为显著。放大倍数依次为 20×40× <p align="center">  实验结果显示在使用化学治疗药物后肿瘤细胞出现明显的凋亡和死亡现象。 ( 图 7A-B) 与此同时，在加入乐沙定的结肠癌模型的细胞培养液中的癌胚抗原的浓度显著降低为 10.34 ng/mL ，而在未加入乐沙定的对照结肠癌模型中癌胚抗原为 65.43ng/mL 。   <table cellspacing="0" cellpadding="0" align="center"><tbody><tr><td valign="top" width="254"><img height="163" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image036.jpg" width="240" alt=""/></td><td valign="top" width="269"><img height="165" src="file:///F:/CSCO2006/AutoPlay/Docs/images/clip_image037.jpg" width="250" alt=""/></td></tr></tbody></table>A B <p align="center">图 7 <p align="center">图 7A 结肠癌细胞株（治疗前）， 7B 结肠癌细胞株（治疗后）。显示了在应用乐沙定处理之后肿瘤在三维培养单元中的生长状况。在使用化学治疗药物后肿瘤细胞出现明显的凋亡和死亡现象。放大倍数为 2 0 ×   三、讨论   （一）提供适合于肿瘤细胞运动和生长的三维空间使其形成类似于体内的癌和微小癌与传统的细胞培养系统相比，我们的三维肿瘤模型更好地代表了体内肿瘤包括形态学在内的生物学特性。我们的模型的一个明显的好处是它结合了二维培养和三维培养系统的共同的优点。所构建的三维肿瘤具有与体内肿瘤相似的生物学特征，同时肿瘤对于治疗的反应如细胞学和形态学的变化都可在类似于二维培养条件下用显微镜观察。通过三维细胞培养单元为肿瘤细胞的生长提供了近似于体内生长的空间和结构，同时也提供了利于细胞黏附和生长的细胞外基质和生长因子，促进细胞和细胞基质以及细胞和细胞之间的交互作用。（二）用生物可降解材料制成可透见的三维空间培养系统所发明的这一三维空间培养系统是可透见的 . 在这一系统中培养的细胞生长乃至所发展形成肿瘤的整个过程可进行随时的观查和动态的追踪。本方法对肿瘤浸润和转移这一过程可动态观察达几个月之久同时并不损坏标本，因此可研究各种抗癌制剂的长期作用。我们的模型不仅可用于研发一般的抗癌制剂，同时可被用来作为体外分子靶点治疗筛选针对预防和治疗肿瘤浸润和转移而设计的药物。开发针对转移过程和微小转移灶的抗恶性肿瘤药 , 是提高恶性肿瘤治愈率、降低治疗后复发率和死亡率、延长患者生命的一个最主要的途径。我们的这一肿瘤生物模型为肿瘤的浸润和转移这一临床上十分重要同时又是非常困难的研究提供了一个宝贵方法。（三）肿瘤细胞可和其他细胞或者多种细胞复合培养根据各种不同的需要和具体的实验条件，两种或两种以上的细胞可在这一培养系统中共同或分别培养。这可以从细胞水平和分子水平观察细胞之间的交互影响。如观察细胞与细胞之间，或细胞与细胞外基质之间的交互作用和影响，细胞接触，激活或细胞接触抑制。观察不同细胞所分泌的激素，生长因子，受体，免疫球蛋白，细胞因子。并可研究激素的旁分泌，自分泌，细胞因子，神经肽，神经递质等共同组成的复杂的细胞间信号分子系统在恶性肿瘤发生和进展以及细胞凋亡过程中对肿瘤细胞的影响。另外和其他细胞或者多种细胞的复合培养亦可用于研究免疫细胞和肿瘤细胞之间的反应和影响，用以帮助免疫诊断和指导免疫治疗。（四）在这一培养系统中肿瘤细胞可分泌肿瘤相关抗原肿瘤细胞分泌肿瘤相关抗原这一生物学特性研究将有利于恶性肿瘤的临床诊断和预后判断的研究。同时由于本系统所培养的细胞可长期生长并保持细胞特有的功能，本系统可为体外研究恶性肿瘤的模型。作为代谢的转换系统和待试器官来筛选各种致癌物质，各种抗癌药物和生理细胞活性分子，生长调节因子。研究药物代谢的改变和抗癌药物耐药性形成的机制。本系统具有能在各种可以任意调控的环境条件下观察肿瘤细胞和肿瘤的形态学，可用于观察激素，生长因子，营养物质，代谢产物和药理活性因子对其生长的影响。（五）恶性肿瘤细胞在这一三维培养系统中可以形成大小不等的肿瘤肿瘤细胞在这一培养系统中所形成的体积小的肿瘤模型可用于肿瘤的早期诊断和治疗。小肝癌研究促进了诊断、治疗与预后等概念的更新和促进了基础研究的开展 [3] 。随着三维适形放射治疗的发展 , 也带来一些新的问题和新的要求。例如相应的三维治疗的生物效应模式。本发明系统所提供的体外实体肿瘤模型也可用于这一生物效应模式方面研究。同样还可用于其他类似方面的研究，比如进一步了解肿瘤的冷冻、激光及其他物理疗法对肿瘤组织和细胞的生物学效应 , 包括生物化学、生物物理和免疫学研究。（六）肿瘤细胞在这一系统中可被大量扩增和无损伤回收这一三维空间培养系统可用来培养细胞和生产大量肿瘤细胞。细胞在三维空间这一类似于体内的生长环境可长期生长，增生，保持其特有的功能和特性。因此不仅可产生大量可供进一步研究或应用的细胞，同时可获得大量细胞活性产物，例如各种细胞因子。本系统培养所获得的实体肿瘤还可移植到动物体内，以观察肿瘤的血管形成、肿瘤与宿主的关系以及肿瘤的免疫反应等的进一步研究。（七）肿瘤的克隆性生长特性可用于高转移细胞株的分离和鉴定临床上经常遇到有些肿瘤随着时间的延长 , 其侵袭性更强、恶性程度更高。这种情况是肿瘤又一次质变 , 不同于肿瘤细胞数目增多、体积增大等量方面的改变。肿瘤进展恶性程度增加 ( 包括加速生长、侵袭及远处转移等行为 ) 的生物学基础就是肿瘤内部不断出现具有不同表型的亚群 , 有的亚群有较快的生长速度 , 有的具有更强的侵袭性 , 有的具有更高的转移潜力 , 有的具有更弱的抗原性以逃避人体的免疫机制。我们的肿瘤生物模型可用于分离鉴定在肿瘤细胞群体中的高转移性细胞亚系，筛选出转移性潜能高低不同的细胞，并对这些细胞与侵袭和转移相关的生物学特性如遗传密码、细胞表面结构、受体种类和分布、抗原特性、代谢特性、侵袭力、与血管内皮细胞等的粘连力、产生局部血凝因子或肿瘤血管和淋巴管生成因子的能力，以及对免疫反应的应答力等进行研究。（八）肿瘤干细胞的分离和鉴定及其研究。实体肿瘤异质性的另一方面是只有少数细胞在培养中或体内呈 “ 克隆优势 ” 生长现象。这些肿瘤细胞可能是肿瘤干细胞。由于绝大多数具有克隆起源的肿瘤产生肿瘤的癌细胞一定会产生具有不同基因表型的细胞，包括只具有有限再生能力或无再生能力的肿瘤细胞，或是具有无限增生能力的癌细胞，这提示产生肿瘤病的癌细胞经历的生长过程是和正常干细胞自我增生和分化的过程是相似的。如果实体肿瘤的生长是由肿瘤干细胞驱使的，那麽将对癌症的治疗带来深远的影响 [4] 。本发明的三维空间培养系统可在体外观查肿瘤细胞的 " 克隆优势 " 生长现象和继发性肿瘤的形成。这将有助于肿瘤干细胞的分离和鉴定，针对肿瘤干细胞的治疗药物和方法将会取得更持久的疗效，甚至达到治愈转移性肿瘤的效果。（九）用于体外观察肿瘤对治疗的反应体外测定和查明不同个体对肿瘤药物的反应可用来设计针对每个病人的肿瘤生物学的特征的专一性的治疗方案。通过筛除没有反应的药物，病人可以避免不必要的毒性反应，而选择在体外有效的药物可增加有效反应的概率。体外测试药物的反应可把目前依靠经验来选择化学治疗方法和将来使用通过肿瘤生物学和生化学的特征来制定治疗方案联系起来。把所有的相关的临床因素整合起来再加上体外药物测定的反应可为癌症患者的治疗提供最佳的效果 [5,6] 。这一三维肿瘤模型将可能为多学科治疗战略提供一个宝贵的生物模型来筛选各种治疗方法的潜在性效果，包括针对那些具有高浸润和转移潜能的肿瘤细胞来预防肿瘤的转移以及针对肿瘤干细胞来限制肿瘤的复发。（十）肿瘤细胞在这一系统中可早期形成肿瘤并在体外培养的条件中长期生长肿瘤细胞在这一系统中可在早期（ 48 ～ 72 小时）就形成肿瘤，同时也可以在体外培养的条件中长期生长达数月之久。再加上本发明的上述的其他特点，比如可透见性和在任何时间对肿瘤细胞进行动态观察。这些优点使本发明的三维细胞培养系统非常适合于肿瘤发展形成这一多阶段、多步骤的复杂过程的观察。总而言之，这一类似于体内环境的细胞生长，增生和发展过程的体外实体肿瘤生物模型将对肿瘤的指导预防、辅助诊断、改进治疗和评估预后多方面的研究提供非常宝贵的作用。   参考文献 •  汤钊猷 . 见汤钊猷主编 . 现代肿瘤学 ( 第 2 版 ). 上海 . 复旦大学出版社 , 2000.1-8. •  Bates RC, Edwards NS, Yates JD. Spheroids and cell survival. Critical Reviews in Oncology/Hematology, 2000,36:61-74. •  刘华 , 叶胜龙 , 朱无难 , 等 . 肝癌患者血浆、红细胞、癌组织和肝组织中色氨酸含量的变化及其意义 . 中华消化杂志 , 1987,7:206-207. •  Raya T, Morrison SJ, Clarke MF, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature, 2001,414:105-111. •  Fruehauf JP. In vitro assay-assisted treatment selection for women with breast or ovarian cancer. Endocrine- Related Cancer , 2002, 9:171-182. •  刘华 , 杨炜 . 三维肿瘤生物模型用于体外观察肿瘤对治疗的反应 . 肿瘤 , 2006, 特刊 150.
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