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肿瘤基因治疗研究进展
孔为民 孙建衡 林晨
基因治疗是指将外源基因或核酸导入人体防治疾病的一种新技术和新的治疗方法。出于对肿瘤是一种基因病的认识【1】，加之恶性肿瘤发病率、死亡率较高，这使得肿瘤基因治疗的研究成为近20年来基因治疗的主要研究内容和热点【2】。
肿瘤基因治疗的实施主要包括以下三个方面：①寻找具有治疗意义的目的基因；②建立有效的向靶细胞转移目的基因的载体系统；③使目的基因在靶细胞中表达，发挥生物学效应，达到治疗目的。现分别综述如下:
一、肿瘤基因治疗选用的外源基因：
肿瘤基因治疗是通过将外源基因导入目的细胞并有效表达从而达到治疗目的。按靶基因的功能分为以下几种：
1、抑癌基因的导入和癌基因的反义核酸导入治疗：
癌细胞不同于正常细胞的生长表型缘于其基因水平上抑癌基因突变、失活和（或）癌基因的突变、扩增、过度表达。针对前者可以将具有正常功能的野生型抑癌基因通过各种途径转染至肿瘤细胞中，重建失活的抑癌基因功能，恢复细胞的正常生长表型，或者诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。对于后者，可通过转化质粒到肿瘤细胞中表达出反义RNA、或直接给予反义寡核苷酸、或予特异的核酶处理，从而达到抑制异常活化癌基因的目的。
目前抑癌基因治疗在肿瘤基因治疗中较为活跃，其中研究较多的是p53基因。1990年Baker【3】等首先观察到p53导入肿瘤细胞后，肿瘤细胞出现了明显的凋亡。Roth于1993年应用载有野生型p53的重组逆转录或腺病毒载体进行人体肺癌的实验治疗，出现了8%的部分缓解率，64%病情稳定的效果【4、5】。美国已从1995年起进行了重组腺病毒p53制品的临床试验（参见本文第五部分）。
针对癌细胞癌基因异常活化而设计的反义核酸技术可有效调节肿瘤细胞中基因表达。具体应用方法有二：一是利用质粒载体或病毒载体转化或转染肿瘤细胞，在细胞内转录出能与目的基因正义RNA相互补的反义RNA，从而阻断目的基因蛋白质的表达；二是体外人工合成反义寡核苷酸。由于第二种方法相对简单，故多数反义核酸基因治疗研究均采用了这种技术【6】。反义核酸基因治疗在靶基因选择上，可以分为癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体细胞信号传导系统、细胞周期调控物质、酶类及其它【7】。反义核酸基因治疗不但在体外实验和动物模型上取得了显著效果，临床试验亦显示出良好效果【8】。
2、免疫基因疗法：
由于在肿瘤的发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于肿瘤细胞本身的免疫性不强（如MHC表达不足），也可源于抗原递呈细胞（APC）不能提供足够的共刺激信号（如B7），或者机体免疫因子分泌不足等。因此可以通过以下三种方法纠正机体肿瘤免疫的耐受状态【9】。
(1)、将某些细胞因子（如IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF等）的基因转染到机体免疫细胞（如TIL、LAK细胞及细胞毒淋巴细胞）中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力，这实质上是免疫治疗加上基因转染技术。这些细胞因子的基因治疗在一定程度上克服了细胞因子注射疗法需反复多次应用、副作用严重等缺点，疗效也有提高。肿瘤免疫细胞因子基因治疗因其简单、有效、安全，已成为肿瘤免疫基因治疗研究的最常用方法。
（2）由于肿瘤细胞存在功能性MHC I类抗原和（或）共刺激信号表达不足，可以将一些与免疫识别有关的基因（如HLA、B7等）转染到体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者体内；或者将表达HLA-B7的病毒载体或质粒DNA与脂质体复合物直接注射到瘤体内，以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应。
（3）制备肿瘤DNA瘤苗，即将编码特异抗原的基因直接注入人体，通过其在机体内的表达从而可以激发机体对编码抗原的免疫反应。如应用癌胚抗原（CEA）【10】制备的肿瘤DNA瘤苗在实验中显示出一定的效果。
3、自杀基因疗法
将某些细菌及病毒中特有的药物敏感基因转导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生某些酶类，将原来无毒的抗病毒药物或化疗前体药物代谢转化成细胞毒性产物而杀伤宿主细胞，这种使肿瘤细胞自杀的基因称为自杀基因。目前肿瘤基因治疗中广泛应用并举有较好临床前景的自杀基因主要有：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）和细菌胞嘧啶脱氨酶基因（CD）。 如Nagy等【11】利用HSV1-tk重组逆转录病毒质粒实验发现HSV1-tk基因转导的结肠癌细胞和肝癌细胞对GCV（丙氧鸟苷）毒性反应的敏感性较其亲本细胞高1000倍。
自杀基因疗法可以实现选择性原位转导和特异性杀伤，避免了应用ex vivo技术基因疗法中步骤繁多、技术要求高、难度大的靶细胞获取及培养、目的基因转导、筛选及回输等过程，从而使其成为较早进入临床的基因治疗方法之一。
4、抗肿瘤血管形成基因治疗：
考虑到血管形成在肿瘤发生中的重要作用，抗血管形成的治疗成为非常有潜力的控制肿瘤生长的治疗方法。虽然在研究中发现近年发展的血管生成抑制剂Angiostatin和Endostatin对肿瘤动物模型有明确疗效【12】，但是长期而系统地给予蛋白质药物代价昂贵，且需经常给药，抗血管生成基因治疗在较大程度上解决了这一问题。近年来抗血管生成基因治疗的研究主要包括：（1）针对血管形成生长因子及其受体的基因治疗【13】；（2）血管形成抑制因子基因治疗【14】；（3）针对肿瘤血管内皮细胞的自杀基因治疗【15】等。这些方法通过特异作用于瘤床的微血管内皮细胞而控制肿瘤生长，虽然目前抗血管形成基因治疗尚未进入临床，但可以相信其会有较广泛的临床应用前景。
5、耐药基因基因治疗
多药耐受基因（MDR）是研究较广泛的一组耐药基因，可将细胞内的药物包括化疗药物泵出细胞外，细胞可因此对化疗药物产生耐受。利用MDR的这种作用可设计出两种基因治疗的方法：一种是应用反义RNA技术，以抑制异常活化的MDR基因，从而达到逆转肿瘤细胞化疗耐药的作用【16】（具体方法见前述）；另一种是将MDR基因导入造血干细胞，获表达后可使骨髓细胞产生对化疗药物的抗性，抵御化疗药物的损害，从而达到增加化疗药物剂量，进而提高化疗疗效的目的【17】。Hanania等【17】发现将在体外经MDR1基因修饰后的裸鼠骨髓造血干细胞回输入人卵巢癌或乳腺癌裸鼠化疗模型体内，可明显提高泰素用量。
二、基因转移的方式及所采用的载体
目的基因成功转移入靶细胞是基因治疗最重要的环节。目前肿瘤基因治疗方式可分为间接体内（回体法）(ex vivo)和直接体内（in vivo）两种。所谓间接体内（回体法）就是将靶细胞由患者体内取出，于体外完成基因转移后再回输患者体内，此种方法的优点为靶细胞明确、转染效率高；而直接体内是将目的基因插入载体，经修饰后直接注入肿瘤部位或通过血液循环注入体内，在体内完成向靶细胞的基因转移，具有一定盲目性,转染效率低，但较前者简便、费用低，已被越来越多的临床研究所选用。
肿瘤基因治疗基因转移方法较多，可分为物理、化学和生物三大类。前两种是非病毒方法，包括裸露DNA直接注射、多价阳离子-DNA复合物转化，电转化，脂质体共转化和受体介导的转化等。第三种方法为病毒方法，指通过携带有目的基因的病毒感染靶细胞并表达出目的基因的方法。
（一）肿瘤基因转移非病毒载体方法：
理化方法介导的基因转移（非病毒载体）是目前发展较快的新型载体系统，具有明显优势：除了较病毒载体系统低毒和低免疫反应之外，其携带的外源基因整合到宿主基因组中的几率很低。非病毒载体系统不受基因插入片断大小的限制,还有使用简单、获得方便、便于保存和检验等特点。目前常用的具有实践价值的理化方法介导基因转移的方法有DNA直接注射、脂质体介导的共转化和阳离子多肽系统基因转移系统（Ployplexes）（主要为受体介导的基因转移系统）等【9】。
（二）、病毒载体系统
病毒载体利用了病毒天然的或改造的外壳和（或）外膜结构来装载目的基因。目前常用做基因治疗病毒载体系统的有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、等。这些病毒载体系统各有优缺点，其中又以前两者在基因治疗中应用最广。现分述如下：
１、逆转录病毒（RV）载体：
迄今为止的人类基因治疗的载体，约有60%是用复制缺陷型的逆转录病毒【9】，其中最广泛使用的又是Moloney鼠白血病病毒MoMuLV）。其生物学特性有：可感染分裂细胞；可整合到宿主染色体中；表达时间较长。其用于基因治疗的优点是受体分布广泛，存在于几乎所有的人类细胞上，因而对细胞的感染谱广，特别是对分裂细胞感染效率较高。缺点有：仅整合到处于增殖状态的细胞；允许插入的的外源基因小于8kb，随机整合插入有诱变危险、组织或细胞选择性不高等。由于其插入诱变危险，因此RV更适合于进行离体基因治疗。
2、腺病毒（Adv）载体【18】
腺病毒载体中腺病毒基因组上的E1A和E1B基因已被目的基因所取代，因而在普通体内缺乏复制能力；仅在染色体上已整合有E1A和E1B的包装细胞（如293细胞）中，复制缺陷型的重组腺病毒才能包装成完整的腺病毒颗粒。其生物学特性有：可感染分裂和非分裂细胞；不整合到染色体中；外源基因表达水平高；表达时间较短；免疫原性强。作为基因治疗载体的优点；易于培养和纯化；允许插入外源基因可达35kb；病毒滴度高，可达1011pfu/ml；可原位感染组织，如肺等。其缺点有：免疫原性强，可刺激机体产生免疫反应；重组、纯化费时；几乎可以感染所有细胞，而缺乏特异性。
腺病毒不会整合到宿主染色体中的特点使其成为体内（in vivo）基因治疗最常用的方法之一。
３、腺相关病毒（AAV）载体： AAV是目前基因治疗载体系统研究的热点之一。其生物学特点有：可感染分裂和非分裂细胞；可整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱。其用于基因治疗的优点有：安全性好；基因组小而易于操作。大部分基因可被替代而保留感染能力；感染谱广，能感染分裂期和非分裂期细胞；利用包装细胞，在体外可制备高滴度病毒;放射线照射可以使病毒从潜隐感染进入复制状态,为基因治疗联合放射治疗创造了条件。缺点是装载外源基因容量有限(不超过4.9kb)，亦可能出现免疫排斥反应。
4、嵌合型病毒载体
病驹靥逖芯康淖钚路较蚩赡苁枪菇ㄈ诙嘀植《居诺阌谝簧淼那逗闲筒《驹靥濉Ｈ鏒ubensky等【19】将HPV的复制子和反式激活因子E1的序列组装入重组腺病毒载体，重组腺病毒载体感染细胞后，依照HPV的一套复制子，游离在细胞染色体之外的载体基因组能复制并产生有感染力的病毒颗粒。
三、肿瘤基因治疗的靶向性和目的基因调控的研究
肿瘤基因治疗中目的基因有选择的进入肿瘤细胞等靶细胞（靶向性基因治疗），是治疗成功的关键。近年来，人们对这些方面进行了广泛研究，并提出了许多方案。如通过改进给药途径和方式，或通过修饰载体和基因，均可望提高肿瘤基因治疗的定向性和可控性。
1、给药途径：
肿瘤基因治疗给药途径中，最多见的是向肿瘤组织直接注射，或者在超声或CT导向下定位注射【20】。这种方法简单易行，常用于体表的晚期肿瘤。但由于使用时很难达到瘤内均匀分布，虽然有所谓旁观者效应的存在，仍可能使疗效受一定影响。对于盆腹腔肿瘤可以采取腹腔注射的方法。而肺癌基因治疗则可采取气管内给药的方式。
2、载体构建
构建出能特异结合进入靶细胞的载体是实现肿瘤基因治疗定向性的主要工作。目前这方面研究较活跃，具体研究成果有：
（1）利用某些病毒能选择性感染人体特异组织的性能，选择和构建特异性载体。如EB病毒和B淋巴细胞和鼻咽上皮细胞等。Kenney等【21】以EB病毒为基础，构建出表达胞苷脱氨酶基因的载体，结果显示有无复制能力的载体均可感染EB病毒受体CD21阳性的细胞。）
（2）利用肿瘤细胞表达的一些相对特异的受体来构建载体。如研究发现VEGF在黑色素瘤、大肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中表达升高，Li等【22】据此设计了含VEGF受体结合区的多肽，并将之与目的基因相连，可以介导目的基因在表达VEGF受体的细胞特异性转导。
3、目的基因的调控
对目的基因的修饰，主要是为了能在局部选择性的攻击肿瘤细胞，即通过构建含有细胞特异性启动子序列的重组载体来调控目的基因定向的仅表达于肿瘤细胞。如AFP启动子对肝肿瘤细胞的选择性【23】等。
四、肿瘤基因治疗的临床试验
由于晚期肿瘤病人治疗的棘手性，肿瘤基因治疗在较早时间作为试验性的治疗即进入了临床。1989年Rosenberg就首次对人恶性黑色素病患者进行了基因治疗【24】，以后这类研究层出不穷，不少研究也显示出基因治疗的临床疗效。目前这类报告不断增多，许多制剂已进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验，甚至已有进入Ⅲ期临床试验的报告。
常用于肿瘤的基因治疗临床试验的目的基因有抑癌基因（如p53）、自杀基因、耐药基因、反义基因等。目前研究较多的是p53基因，主要是重组腺病毒p53。美国自1995年以来即开始了重组腺病毒p53制品的临床试验，并已完成了Ⅰ、Ⅱ期临床试验及部分Ⅲ期临床试验。2000年3月，其对Ⅰ~Ⅲ期400多例晚期透镜部恶性肿瘤病人临床试验评估结果表明：Ad-p53制品安全，有60%病人肿瘤停止生长或缩小【25】。 我国目前亦已有Ad-p53、V-erbB反基因寡核苷酸、IL-2基因工程人胃癌细胞瘤苗、胸苷激酶基因工程化细胞制剂等待批或获批临床试验【25】。其中胸苷激酶基因工程化细胞制剂在进行Ⅰ期临床试验，Ad-p53（SBN-1）已完成Ⅰ期临床试验进入Ⅱ期临床试验。
总之，10余年来所进行的肿瘤基因临床试验已表明，基因治疗不仅作为一个新的生物医学概念而为人们所接受，而且作为一种新的治疗手段和方法已被广大研究人员和临床工作者所实践。到目前为止所进行的不少研究表明，基因治疗实验是安全的、有效和易于操作的。
五、肿瘤基因治疗存在的问题和发展方向
肿瘤基因治疗目前还处于发展的早期，其在体外或动物实验上的许多理想结果尚不能在人体上完全显现，其在临床实践中的应用还面临许多困难。例如：如何选择更有效的目的基因、如何确保载体的安全性、如何将带有治疗作用的载体高效率的转移到人体内、如何保持这些重组载体在人体内长期和稳定的高效表达出预定的基因产物、如何有效地将基因治疗与其他治疗方法的联合应用以及如何更有效的减轻人体对重组载体的免疫作用等，都是当前基因治疗实践中所遇到的重大困难。（事实上，这些难点都是目前肿瘤基因治疗研究的热点，并在不断出现新的进展。）
随着人类基因组计划的完成，肿瘤相关基因的揭示，肿瘤发病分子机理的深入阐明、DNA转移技术的革新，以及对于在体内重组载体表达的调控技术的提高，肿瘤的基因治疗必将在肿瘤的治疗中起重要作用，基因治疗在现代临床医学中具有广阔的前景。
孔为民 孙建衡 林晨
基因治疗是指将外源基因或核酸导入人体防治疾病的一种新技术和新的治疗方法。出于对肿瘤是一种基因病的认识【1】，加之恶性肿瘤发病率、死亡率较高，这使得肿瘤基因治疗的研究成为近20年来基因治疗的主要研究内容和热点【2】。
肿瘤基因治疗的实施主要包括以下三个方面：①寻找具有治疗意义的目的基因；②建立有效的向靶细胞转移目的基因的载体系统；③使目的基因在靶细胞中表达，发挥生物学效应，达到治疗目的。现分别综述如下:
一、肿瘤基因治疗选用的外源基因：
肿瘤基因治疗是通过将外源基因导入目的细胞并有效表达从而达到治疗目的。按靶基因的功能分为以下几种：
1、抑癌基因的导入和癌基因的反义核酸导入治疗：
癌细胞不同于正常细胞的生长表型缘于其基因水平上抑癌基因突变、失活和（或）癌基因的突变、扩增、过度表达。针对前者可以将具有正常功能的野生型抑癌基因通过各种途径转染至肿瘤细胞中，重建失活的抑癌基因功能，恢复细胞的正常生长表型，或者诱导肿瘤细胞凋亡，从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。对于后者，可通过转化质粒到肿瘤细胞中表达出反义RNA、或直接给予反义寡核苷酸、或予特异的核酶处理，从而达到抑制异常活化癌基因的目的。
目前抑癌基因治疗在肿瘤基因治疗中较为活跃，其中研究较多的是p53基因。1990年Baker【3】等首先观察到p53导入肿瘤细胞后，肿瘤细胞出现了明显的凋亡。Roth于1993年应用载有野生型p53的重组逆转录或腺病毒载体进行人体肺癌的实验治疗，出现了8%的部分缓解率，64%病情稳定的效果【4、5】。美国已从1995年起进行了重组腺病毒p53制品的临床试验（参见本文第五部分）。
针对癌细胞癌基因异常活化而设计的反义核酸技术可有效调节肿瘤细胞中基因表达。具体应用方法有二：一是利用质粒载体或病毒载体转化或转染肿瘤细胞，在细胞内转录出能与目的基因正义RNA相互补的反义RNA，从而阻断目的基因蛋白质的表达；二是体外人工合成反义寡核苷酸。由于第二种方法相对简单，故多数反义核酸基因治疗研究均采用了这种技术【6】。反义核酸基因治疗在靶基因选择上，可以分为癌基因、抑癌基因、生长因子及其受体细胞信号传导系统、细胞周期调控物质、酶类及其它【7】。反义核酸基因治疗不但在体外实验和动物模型上取得了显著效果，临床试验亦显示出良好效果【8】。
2、免疫基因疗法：
由于在肿瘤的发生发展过程中存在着机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫耐受状态，而这种状态可能源于肿瘤细胞本身的免疫性不强（如MHC表达不足），也可源于抗原递呈细胞（APC）不能提供足够的共刺激信号（如B7），或者机体免疫因子分泌不足等。因此可以通过以下三种方法纠正机体肿瘤免疫的耐受状态【9】。
(1)、将某些细胞因子（如IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF等）的基因转染到机体免疫细胞（如TIL、LAK细胞及细胞毒淋巴细胞）中，以提高机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和反应能力，这实质上是免疫治疗加上基因转染技术。这些细胞因子的基因治疗在一定程度上克服了细胞因子注射疗法需反复多次应用、副作用严重等缺点，疗效也有提高。肿瘤免疫细胞因子基因治疗因其简单、有效、安全，已成为肿瘤免疫基因治疗研究的最常用方法。
（2）由于肿瘤细胞存在功能性MHC I类抗原和（或）共刺激信号表达不足，可以将一些与免疫识别有关的基因（如HLA、B7等）转染到体外培养的肿瘤细胞，经照射后再植入肿瘤患者体内；或者将表达HLA-B7的病毒载体或质粒DNA与脂质体复合物直接注射到瘤体内，以增强肿瘤细胞对机体免疫系统的免疫原性，诱导宿主的免疫反应。
（3）制备肿瘤DNA瘤苗，即将编码特异抗原的基因直接注入人体，通过其在机体内的表达从而可以激发机体对编码抗原的免疫反应。如应用癌胚抗原（CEA）【10】制备的肿瘤DNA瘤苗在实验中显示出一定的效果。
3、自杀基因疗法
将某些细菌及病毒中特有的药物敏感基因转导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞产生某些酶类，将原来无毒的抗病毒药物或化疗前体药物代谢转化成细胞毒性产物而杀伤宿主细胞，这种使肿瘤细胞自杀的基因称为自杀基因。目前肿瘤基因治疗中广泛应用并举有较好临床前景的自杀基因主要有：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）和细菌胞嘧啶脱氨酶基因（CD）。 如Nagy等【11】利用HSV1-tk重组逆转录病毒质粒实验发现HSV1-tk基因转导的结肠癌细胞和肝癌细胞对GCV（丙氧鸟苷）毒性反应的敏感性较其亲本细胞高1000倍。
自杀基因疗法可以实现选择性原位转导和特异性杀伤，避免了应用ex vivo技术基因疗法中步骤繁多、技术要求高、难度大的靶细胞获取及培养、目的基因转导、筛选及回输等过程，从而使其成为较早进入临床的基因治疗方法之一。
4、抗肿瘤血管形成基因治疗：
考虑到血管形成在肿瘤发生中的重要作用，抗血管形成的治疗成为非常有潜力的控制肿瘤生长的治疗方法。虽然在研究中发现近年发展的血管生成抑制剂Angiostatin和Endostatin对肿瘤动物模型有明确疗效【12】，但是长期而系统地给予蛋白质药物代价昂贵，且需经常给药，抗血管生成基因治疗在较大程度上解决了这一问题。近年来抗血管生成基因治疗的研究主要包括：（1）针对血管形成生长因子及其受体的基因治疗【13】；（2）血管形成抑制因子基因治疗【14】；（3）针对肿瘤血管内皮细胞的自杀基因治疗【15】等。这些方法通过特异作用于瘤床的微血管内皮细胞而控制肿瘤生长，虽然目前抗血管形成基因治疗尚未进入临床，但可以相信其会有较广泛的临床应用前景。
5、耐药基因基因治疗
多药耐受基因（MDR）是研究较广泛的一组耐药基因，可将细胞内的药物包括化疗药物泵出细胞外，细胞可因此对化疗药物产生耐受。利用MDR的这种作用可设计出两种基因治疗的方法：一种是应用反义RNA技术，以抑制异常活化的MDR基因，从而达到逆转肿瘤细胞化疗耐药的作用【16】（具体方法见前述）；另一种是将MDR基因导入造血干细胞，获表达后可使骨髓细胞产生对化疗药物的抗性，抵御化疗药物的损害，从而达到增加化疗药物剂量，进而提高化疗疗效的目的【17】。Hanania等【17】发现将在体外经MDR1基因修饰后的裸鼠骨髓造血干细胞回输入人卵巢癌或乳腺癌裸鼠化疗模型体内，可明显提高泰素用量。
二、基因转移的方式及所采用的载体
目的基因成功转移入靶细胞是基因治疗最重要的环节。目前肿瘤基因治疗方式可分为间接体内（回体法）(ex vivo)和直接体内（in vivo）两种。所谓间接体内（回体法）就是将靶细胞由患者体内取出，于体外完成基因转移后再回输患者体内，此种方法的优点为靶细胞明确、转染效率高；而直接体内是将目的基因插入载体，经修饰后直接注入肿瘤部位或通过血液循环注入体内，在体内完成向靶细胞的基因转移，具有一定盲目性,转染效率低，但较前者简便、费用低，已被越来越多的临床研究所选用。
肿瘤基因治疗基因转移方法较多，可分为物理、化学和生物三大类。前两种是非病毒方法，包括裸露DNA直接注射、多价阳离子-DNA复合物转化，电转化，脂质体共转化和受体介导的转化等。第三种方法为病毒方法，指通过携带有目的基因的病毒感染靶细胞并表达出目的基因的方法。
（一）肿瘤基因转移非病毒载体方法：
理化方法介导的基因转移（非病毒载体）是目前发展较快的新型载体系统，具有明显优势：除了较病毒载体系统低毒和低免疫反应之外，其携带的外源基因整合到宿主基因组中的几率很低。非病毒载体系统不受基因插入片断大小的限制,还有使用简单、获得方便、便于保存和检验等特点。目前常用的具有实践价值的理化方法介导基因转移的方法有DNA直接注射、脂质体介导的共转化和阳离子多肽系统基因转移系统（Ployplexes）（主要为受体介导的基因转移系统）等【9】。
（二）、病毒载体系统
病毒载体利用了病毒天然的或改造的外壳和（或）外膜结构来装载目的基因。目前常用做基因治疗病毒载体系统的有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、等。这些病毒载体系统各有优缺点，其中又以前两者在基因治疗中应用最广。现分述如下：
１、逆转录病毒（RV）载体：
迄今为止的人类基因治疗的载体，约有60%是用复制缺陷型的逆转录病毒【9】，其中最广泛使用的又是Moloney鼠白血病病毒MoMuLV）。其生物学特性有：可感染分裂细胞；可整合到宿主染色体中；表达时间较长。其用于基因治疗的优点是受体分布广泛，存在于几乎所有的人类细胞上，因而对细胞的感染谱广，特别是对分裂细胞感染效率较高。缺点有：仅整合到处于增殖状态的细胞；允许插入的的外源基因小于8kb，随机整合插入有诱变危险、组织或细胞选择性不高等。由于其插入诱变危险，因此RV更适合于进行离体基因治疗。
2、腺病毒（Adv）载体【18】
腺病毒载体中腺病毒基因组上的E1A和E1B基因已被目的基因所取代，因而在普通体内缺乏复制能力；仅在染色体上已整合有E1A和E1B的包装细胞（如293细胞）中，复制缺陷型的重组腺病毒才能包装成完整的腺病毒颗粒。其生物学特性有：可感染分裂和非分裂细胞；不整合到染色体中；外源基因表达水平高；表达时间较短；免疫原性强。作为基因治疗载体的优点；易于培养和纯化；允许插入外源基因可达35kb；病毒滴度高，可达1011pfu/ml；可原位感染组织，如肺等。其缺点有：免疫原性强，可刺激机体产生免疫反应；重组、纯化费时；几乎可以感染所有细胞，而缺乏特异性。
腺病毒不会整合到宿主染色体中的特点使其成为体内（in vivo）基因治疗最常用的方法之一。
３、腺相关病毒（AAV）载体： AAV是目前基因治疗载体系统研究的热点之一。其生物学特点有：可感染分裂和非分裂细胞；可整合到染色体中；无致病性；免疫原性弱。其用于基因治疗的优点有：安全性好；基因组小而易于操作。大部分基因可被替代而保留感染能力；感染谱广，能感染分裂期和非分裂期细胞；利用包装细胞，在体外可制备高滴度病毒;放射线照射可以使病毒从潜隐感染进入复制状态,为基因治疗联合放射治疗创造了条件。缺点是装载外源基因容量有限(不超过4.9kb)，亦可能出现免疫排斥反应。
4、嵌合型病毒载体
病驹靥逖芯康淖钚路较蚩赡苁枪菇ㄈ诙嘀植《居诺阌谝簧淼那逗闲筒《驹靥濉Ｈ鏒ubensky等【19】将HPV的复制子和反式激活因子E1的序列组装入重组腺病毒载体，重组腺病毒载体感染细胞后，依照HPV的一套复制子，游离在细胞染色体之外的载体基因组能复制并产生有感染力的病毒颗粒。
三、肿瘤基因治疗的靶向性和目的基因调控的研究
肿瘤基因治疗中目的基因有选择的进入肿瘤细胞等靶细胞（靶向性基因治疗），是治疗成功的关键。近年来，人们对这些方面进行了广泛研究，并提出了许多方案。如通过改进给药途径和方式，或通过修饰载体和基因，均可望提高肿瘤基因治疗的定向性和可控性。
1、给药途径：
肿瘤基因治疗给药途径中，最多见的是向肿瘤组织直接注射，或者在超声或CT导向下定位注射【20】。这种方法简单易行，常用于体表的晚期肿瘤。但由于使用时很难达到瘤内均匀分布，虽然有所谓旁观者效应的存在，仍可能使疗效受一定影响。对于盆腹腔肿瘤可以采取腹腔注射的方法。而肺癌基因治疗则可采取气管内给药的方式。
2、载体构建
构建出能特异结合进入靶细胞的载体是实现肿瘤基因治疗定向性的主要工作。目前这方面研究较活跃，具体研究成果有：
（1）利用某些病毒能选择性感染人体特异组织的性能，选择和构建特异性载体。如EB病毒和B淋巴细胞和鼻咽上皮细胞等。Kenney等【21】以EB病毒为基础，构建出表达胞苷脱氨酶基因的载体，结果显示有无复制能力的载体均可感染EB病毒受体CD21阳性的细胞。）
（2）利用肿瘤细胞表达的一些相对特异的受体来构建载体。如研究发现VEGF在黑色素瘤、大肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中表达升高，Li等【22】据此设计了含VEGF受体结合区的多肽，并将之与目的基因相连，可以介导目的基因在表达VEGF受体的细胞特异性转导。
3、目的基因的调控
对目的基因的修饰，主要是为了能在局部选择性的攻击肿瘤细胞，即通过构建含有细胞特异性启动子序列的重组载体来调控目的基因定向的仅表达于肿瘤细胞。如AFP启动子对肝肿瘤细胞的选择性【23】等。
四、肿瘤基因治疗的临床试验
由于晚期肿瘤病人治疗的棘手性，肿瘤基因治疗在较早时间作为试验性的治疗即进入了临床。1989年Rosenberg就首次对人恶性黑色素病患者进行了基因治疗【24】，以后这类研究层出不穷，不少研究也显示出基因治疗的临床疗效。目前这类报告不断增多，许多制剂已进入Ⅰ、Ⅱ期临床试验，甚至已有进入Ⅲ期临床试验的报告。
常用于肿瘤的基因治疗临床试验的目的基因有抑癌基因（如p53）、自杀基因、耐药基因、反义基因等。目前研究较多的是p53基因，主要是重组腺病毒p53。美国自1995年以来即开始了重组腺病毒p53制品的临床试验，并已完成了Ⅰ、Ⅱ期临床试验及部分Ⅲ期临床试验。2000年3月，其对Ⅰ~Ⅲ期400多例晚期透镜部恶性肿瘤病人临床试验评估结果表明：Ad-p53制品安全，有60%病人肿瘤停止生长或缩小【25】。 我国目前亦已有Ad-p53、V-erbB反基因寡核苷酸、IL-2基因工程人胃癌细胞瘤苗、胸苷激酶基因工程化细胞制剂等待批或获批临床试验【25】。其中胸苷激酶基因工程化细胞制剂在进行Ⅰ期临床试验，Ad-p53（SBN-1）已完成Ⅰ期临床试验进入Ⅱ期临床试验。
总之，10余年来所进行的肿瘤基因临床试验已表明，基因治疗不仅作为一个新的生物医学概念而为人们所接受，而且作为一种新的治疗手段和方法已被广大研究人员和临床工作者所实践。到目前为止所进行的不少研究表明，基因治疗实验是安全的、有效和易于操作的。
五、肿瘤基因治疗存在的问题和发展方向
肿瘤基因治疗目前还处于发展的早期，其在体外或动物实验上的许多理想结果尚不能在人体上完全显现，其在临床实践中的应用还面临许多困难。例如：如何选择更有效的目的基因、如何确保载体的安全性、如何将带有治疗作用的载体高效率的转移到人体内、如何保持这些重组载体在人体内长期和稳定的高效表达出预定的基因产物、如何有效地将基因治疗与其他治疗方法的联合应用以及如何更有效的减轻人体对重组载体的免疫作用等，都是当前基因治疗实践中所遇到的重大困难。（事实上，这些难点都是目前肿瘤基因治疗研究的热点，并在不断出现新的进展。）
随着人类基因组计划的完成，肿瘤相关基因的揭示，肿瘤发病分子机理的深入阐明、DNA转移技术的革新，以及对于在体内重组载体表达的调控技术的提高，肿瘤的基因治疗必将在肿瘤的治疗中起重要作用，基因治疗在现代临床医学中具有广阔的前景。
