药物基因组学研究与肺癌个体化治疗

上海市胸科医院 韩宝惠

同样是非小细胞肺癌甚至是同一种细胞类型的肺癌采用同样的治疗方案和剂量会产生截然不同的治疗结果和毒副反应，是何种原因导致这一现象产生的？回答这一问题首先要了解我们是否在治疗 “ 同一种或同一群 ” 病人，在病理组织学相同的情况下，它们的生物学特性（ 单核苷酸多态性 SPN ）是否存在差异。答案是肯定的，遗传多态性在个体间是存在显著的差别的。这也就是我们所要讨论的起源于 上世纪九十年代末 的一门新兴学科…… 药物基因组学 (pharmacogenomics) ， 药物 基因组 学是基于药物反应的遗传多态性提出来的，遗传多态性是药物 基因组 学的基础。药物遗传多态性表现为药物代谢酶的多态性、药物受体的多态性和药物靶标的多态性等。这些多态性的存在可能导致许多药物治疗中药效和不良反应的个体差异。药物 基因组 学从基因水平揭示这些差异的遗传特征，鉴别基因序列中的差异， 从 基因水平研究药效的差异，并以药物效应及安全性为目标，研究各种基因突变与药效及安全性之间的关系。药物 基因组 学的研究不同于一般的基因学研究，不是以发现新的基因、探明疾病的发生机制、预见发病风险及诊断疾病为目的，而是 从已知基因 素对药物效应的影响，确定药物作用的靶点，研究从表型到基因型的药物反应的个体多样性。 它 将 基因组 技术，如基因测序、基因表达分析、统计遗传学等用于药物的研究开发 手段，同时应用 如凝胶电泳技术、聚合酶链反应、等位基因扩增技术、荧光染色 、 高通量基因检测技术，来检测一些与药物作用的靶点或与控制药物作用、分布、排泄相关的基因变异。 DNA 阵列技术、高通量筛选系统及 生物信息学 等的发展，为药物 基因组 学研究提供了多种手段和思路。药物 基因组 学通过对包括选择药物起效、活化、排泄等过程相关的候选基因进行研究，鉴定基因序列的变异，估计它们在药物作用中的意义，用统计学分析基因突变与药效的关系，将基因的多态性与药物效应的个体多样性紧密联系在一起，并使 其对个体化治疗具有更强的针对性和应用价值 。

当进入二十一世纪，循证医学、靶向治疗的临床应用使人们看到了肺癌治疗的新曙光。循证医学为我们解答了诸如肺癌术后是否辅助化疗的问题，解决了晚期肺癌现代化治疗优于支持治疗，确立了进展期非小细胞肺癌第三代二药含铂一线治疗的地位，以及二线、三线推荐方案 …… 。而新近肺癌靶向治疗的临床应用为我们提供了更丰富的治疗手段和策略。的确，近些年我们不乏见到部分晚期肺癌患者经过多学科综合治疗，获得了 3 年甚至 5 年的长期存活的案例。这其中即包括了如放疗化疗的多学科综合治疗的作用，也不乏一线、二线、三线 …… 姑息治疗等等方法的合理应用。但这些还远远不够，肿瘤学家及临床医师面对的是全部肺癌的 5 年生存率不足 15% 这一严峻的现实。循证医学、靶向治疗这些新的进展可能对进一步提高肺癌的 5 年生存率会有帮助，但如果能进一步提高肺癌的长期生存率， “ 发现治疗靶点，选择准确的患者 ” 这一药物基因组学基本原理和方法，即针对每一位患者制定出最适合于疾病特性的针对性治疗方案，其实就是当今肺癌治疗的热点问题 ――― 个体化治疗。个体化治疗又是建立在循证医学基础上，以药物基因组学研究为依托的一门新兴学科，个体化的最大目标和任务就是要通过各种上述所介绍的有效方法（ DNA 阵列技术、高通量筛选系统及生物信息学 等）获得肺癌治疗获益人群的准确信息指导临床治疗。同时，根据治疗的反应评估和检测不断修正治疗方案，以获取最佳治疗效果，这就是当今肺癌治疗的理想之路。

以肺癌术后辅助化疗为例，经过了 40 年的临床研究，循证医学最终为术后辅助化疗提供了支持证据，但需要指出的是这种支持证据也是极有限的，目前的治疗仍存在较大的盲目性，如最近 10 年 12 个国际多中心共 7334 例研究结果显示非小细胞肺癌术后辅助化疗有助于提高患者的长期生存率，术后化疗患者 5 年无病生存辅助化疗组较对照组提高了 3 ～ 15 个百分点，所采用的基本上是以铂类为主的术后辅助治疗方案。这项研究是在缺乏药物基因组学研究的情况下进行的，人们不禁要问：难道只能有 3 ％～ 15% 患者能够从术后辅助化疗中获益？这 7334 例肺癌中有多少是 “ 铂类 ” 耐药？就目前化疗疗效来讲其疗效仅为 20% ～ 40% ，这其中有超过半数的病例为铂类耐药或对铂类治疗不敏感者。这就意味着对于肺癌术后来讲起码存在二类人群，一是对铂类敏感的术后肺癌和对铂类化疗不敏感或耐药的术后肺癌病人，而目前对术后肺癌的辅助化疗均采用同一种方案。那么是否能根据患者的耐药情况作到针对每一位患者 “ 量体裁衣 ” 即：根据肿瘤生物学特征和药物 基因组 学改变进行有针对性的个体化治疗？

近年来的研究表明，细胞信号传导中相关因子的表达异常、肿瘤细胞 DNA 修复的异常及其它相关基因的表达异常与肺癌耐药的产生存在密切联系。随着肿瘤耐药机制研究的不断深入，目前认为耐药是多种基因参与及多种机制共同作用的结果，不同药物可能由不同的耐药机制引起。同一种药物的耐药可由几种耐药机制介导。因此应用药物基因组学基本原理和方法，针对患者制定出最适合于疾病特性的针对性治疗方案是提高治疗疗效的关键。其中以下几方面为目前研究的热点。

一、 DNA 修复异常与耐药

到目前为止，顺铂仍是治疗肺癌的基础用药，其作用机制除了顺铂与细胞 DNA 的碱基相互作用形成泡状链内铂－ DNA 加合物，引起 DNA 复制障碍，抑制癌细胞的分裂外，泡状链内铂 2DNA 加合物能激活多条信号通路，如 ATR 、 p53 、 p73 、 MAPK 介导的信号通路，诱导细胞发生凋亡。肿瘤细胞 DNA 加合物的修复异常将削弱凋亡过程，产生对顺铂的耐药。

核苷酸切除修复 ( nucleotide excision repair ,NER) 是修复 DNA 损伤的一种重要的途径，其主要功能是识别和修复化疗产生的 DNA 加合物。 NERXPC-HHRAD23 、 XPA 、 RPA 、 TFIIH and XPC 、 XPB 、 XPD 、 ERCC-XPF 、 RFC 、 DNA 连接酶等一大组基因，其中错配切除修复蛋白 (excision repair cross complement-1,ERCC-1) 作为损伤碱基 5′-3′ 的切割酶，起着重要作用。

Ryu 等研究发现 ERCC1 第 118 位密码子的多态性可影响患者的生存率和疗效，基因型为 C/C 的患者中位生存期为 486 天，而基因型为 C/T 或 T/T 的患者中位生存期为 281 天，两者具有显著性差异，因此认为 ERCC1 第 118 位密码子 C/C 基因型可作为预测以顺铂为基础治疗的 NSCLC 患者疗效的指标。但 Lord 等研究发现， ERCC1 mRNA 表达水平低的患者其中位生存期高于 ERCC1 mRNA 表达水平高的患者。 Monzo 等研究了 56 例用健择 / 顺铂化疗的 NSCLC 病人，其反应率与 ERCC1 mRNA 水平呈负相关。

2006 年 ASCO 会议中 Soria 采用标准的免疫组化，检测了国际肺癌临床试验 (IALT) 入组的 783 例手术切除的 NSCLC 患者肿瘤组织中 ERCC1 的表达情况。每例标本根据肿瘤细胞核阳性的百分比和染色强度进行半定量的组织学评分 (H- 评分 ) 。 H- 评分的中位值作为区分 ERCC1 阳性和阴性的分界点。总生存分析采用临床和病理因素调整的 Cox 模型。结果显示，免疫染色后， 783 例中有 761 例 (97%) 标本符合分析条件。 335 例患者 (44%) 的 ERCC1 阳性。含顺铂方案辅助化疗受益与 ERCC1 状态有关 ( P <0.009) 。 ERCC1 阴性的患者随机接受辅助化疗明显延长生存时间，降低死亡风险 ( 风险比 0.67 ， 95% 可信区间 0.51-0.89 ， P <0.006) 。 ERCC1 阳性患者无论是否接受辅助化疗，生存情况没有统计学上的差异 ( 风险比 1.18 ， 95% 可信区间 0.87-1.61 ， P =0.29) 。对随机接受观察的患者进行分析，肿瘤组织中 ERCC1 阳性的亚组患者预后较好 ( 风险比 0.65 ， 95% 可信区间 0.48-0.89 ， P <0.008) 。另一位专家 Matakidou 研究核苷酸切除修复 (NER) 通路基因变异对肺癌预后的影响也得出了相同的结论，该研究对 408 例肺癌患者分析了 NER 相关基因编码的非同义单核苷酸多态 (SNPs) 。肺癌患者的中位年龄是 63 岁，小细胞肺癌 (SCLC) 和非小细胞肺癌 (NSCLC) 分别是 105 例和 299 例。中位随访 24 个月，观察到 234 例患者死亡。 SCLC 和 NSCLC 的平均生存时间分别是 17.3 月和 18.6 月。不管患者是否接受含铂方案化疗， XPG H1104D 纯合型等位基因和 CSB M1097V 、 R1213G 和 Q1413R 杂合基因型与生存降低有关 ( 风险比 2.22 ， 95% 可信区间 1.19-4.16 ， P =0.013 ；风险比 1.39 ， 95% CI ： 1.05-1.84 ， P =0.02) 。风险基因型与诊断时的病理类型和分期没有统计学上的显著相关性。为了评价 SNPs 对含铂方案化疗疗效的预测价值，在含铂和非铂治疗的患者中评价了基因型和生存的关系。未用顺铂的患者中， RAD23B A249V 和 CSB M1097V 等位基因型与总生存降低有关 ( P 值分别是 0.004 和 0.002) ，而 XPC K939Q 等位基因型与生存改善有关 ( P =0.03) 。含铂治疗的患者中， XPG H1104D 等位基因携带者总生存明显降低 ( 对于杂合型等位基因和纯合型等位基因型 P 值分别是 0.04 和 0.004) 。研究显示 NER 基因的多态性可能影响肺癌的预后和含铂方案化疗的疗效，与组织学诊断和肿瘤的临床分期无关。并认为 NSCLC 根治术后肿瘤组织中 ERCC1 检测阴性的患者可以从含顺铂的辅助化疗中明显获益。

二、核苷酸还原酶的异常表达与耐药

核苷酸还原酶（ ribonucleotide reductase ， RR ）是 DNA 合成通路中的限速酶， RR 可使核苷酸二磷酸盐转变为脱氧核苷酸二磷酸盐，从而在 DNA 合成和修复中发挥重要作用。 RR 包括两个亚单位 —RRM1 和 RRM2 ， M1 亚单位控制底物的特异性及酶活性的开 / 关， M2 亚单位包含负责底物转化的催化区。 Rosell 等采用定量 PCR 的方法检测了 75 例 NSCLC 患者的肿瘤标本中 RRM1 mRNA 等的表达，其中有 22 例患者接受了健择 / 顺铂联合化疗，发现低水平表达 RRM1 mRNA 的健择 / 顺铂组患者对化疗的反应较好，健择 / 顺铂组患者的疾病进展时间与 RRM1 mRNA 的表达水平密切相关（ P =0.05 ）。 Jung 等发现 Flavopiridol 可下调 RRM2 亚单位的表达，提示 RRM2 可作为预测对健择反应的重要指标之一。

三、信号传导中有关因子介导的耐药

（一）蛋白激酶 C 与耐药　

蛋白激酶 C(protein kinase C, PKC) 属于丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶家族，它调控生长因子反应及细胞的增殖和凋亡，参与肿瘤的发生、发展和对抗肿瘤药物的反应，这使得它成为较引人注目的肿瘤治疗靶点。 Sonnemann 等使用第二代反义核苷酸降低 PKCθ 的 mRNA 和蛋白水平，并联合使用长春新碱或泰素，结果发现， PKCθ 水平的下调一方面明显增强了凋亡因子 caspase23 的活力，促进了细胞的凋亡；另一方面扩大了长春新碱诱导的线粒体膜蛋白的消耗，增强了 A549 细胞对细胞毒药物的敏感性，因此他们认为 PKCθ 可能是一个重要的治疗靶点。 Clark 等则发现在 NSCLC 中 PKC 亚型较正常细胞表现为增强的磷酸化和异常的表达，他们使用 PKCδ 抑制剂和转染失去激酶活性的突变的 PKCδ 证实了 PKCδ 的抗药性，且两种方法都有效增强了化疗药物诱导的细胞凋亡。目前，进入临床试验的 PKC 分子靶向药物有 ISIS3521( Affinitak) ，它是 PKCmRNA 的反义磷酸化寡核苷酸。临床研究显示， ISIS3521 联合卡铂、紫杉醇治疗 48 例初治 NSCLC 患者，有效率为 42% , 中位生存期为 19 个月， 1 年生存率为 75% ，提示三药联合的疗效优于传统的卡铂 / 紫杉醇方案。另有报道这三药联合用于治疗 50 例化疗失败的 NSCLC 患者，其中位生存期达到 15.9 个月。

（二） PI3-K/ Akt 与耐药　

在酪氨酸激酶受体介导的信号传导系统中，当 PI3-K 被激活时，细胞内第二信号 PIP2 和 PIP3 浓度增高。 Akt 是 PIP2 和 PIP3 重要的下游激酶，激活后参与调控细胞生存、糖原代谢等，与肿瘤细胞的凋亡抑制和肿瘤发生相关。 Akt 活力的增强与肺癌、卵巢癌和乳腺癌的耐药成正比。 Brognard 等发现 17 例 NSCLC 细胞株中有 16 例细胞株存在 Akt 的持续活化，他们认为 Akt 的持续活化可促进细胞的存活并产生对化疗的耐受。 Kandasamy 等使用 PI3-K 的抑制剂，增强了高表达 Akt 的细胞对化疗药物的敏感性，促进了凋亡；而在低表达 Akt 的细胞中这种增强作用不明显。这些研究表明 Akt 介导的细胞耐药可能与凋亡抑制相关。

（三）核转录因子 (NF-kapaB) 与耐药　

Cheng 等发现 NF-kapaB 可通过上调凋亡拮抗基因 Bcl2x 和 Bfl21 的表达引起多药耐药。 Stevenson 等报道了药物 bortezomib( PS2341) 对外周单核细胞中 NF-kapaB 活性影响的 Ⅱ 期药效试验， PS2341 通过抑制 IκB(NF-kapaB 抑制因子 ) 的降解来阻止 NF2kapaB 的活化。结果显示，单药 PS2341 对晚期 NSCLC 具有一定抗肿瘤作用，且毒副反应不显著；在使用 PS2341 后 24 小时内观察到抗凋亡信号的下降，在 4 小时达到高峰。可见阻断 NF2kapaB 通路可增加肿瘤细胞的凋亡。目前需更多的前期临床研究来更好地评价阻断 NF-kapaB 在治疗上的价值。

（四）表皮生长因子受体与耐药　

表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor ,EGFR) 是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，当 EGFR 与配体结合活化后，经过一系列途径将信号传入细胞内，刺激细胞的生长增殖。对 EGFR 在肺癌中分布和表达情况的研究证实： EGFR 在正常肺组织中的表达很低；在 NSCLC 尤其是鳞癌中存在 EGFR 的过度表达。由于 EGFR 的高表达可以促进肿瘤细胞增殖、肿瘤血管生成、粘附、侵袭转移和拮抗肿瘤细胞的凋亡，而且 EGFR 酪氨酸激酶是信号传导的必要条件，因而 EGFR 成为肿瘤治疗的重要靶点。

Bailey 等对 516 例接受 Iressa 联合化疗的病人 ( INTACT1/ 2 分别为 219/ 297) 的病理组织 EGFR 表达情况进行了分析，研究显示 EGFR 的表达与病人应用 gefitinib 的疗效无明显相关性。 Pao 等对 54 例病人的标本进行研究显示， EGFR 、 p-AKT 、 p53 与 gefitinib 疗效无关，但 15 例有效者病人中 12 例 HER2 (+) ，而 28 例无效病人中仅 15 例 HER2 (+) 。 2004 年 ASCO 会议上研究发现基因突变与 gefitinib 疗效间存在重要联系，如 Haber 等对未接受 iressa 治疗的 119 例 NSCLC 进行了 EGFR 18 、 19 、 21 外显子突变检测，结果显示基因突变率为 13%(16/ 119) ，其中日本人突变率 26% 、美国人的突变率为 2% ；腺癌突变率为 21%(15/ 70) 、非腺癌 2%(1/49), 男性突变率 9%(7/74) 、女性 20%(9/45) ，日本女性腺癌的突变率最高为 57%(8/14) 。在 Haber 和 Shells 研究的两组病人中，有效人群总突变率 93 %(13/14) ，无效人群的突变率为 0(0/11) ，疗效为 SD 的病人未检测出突变。 Kobayashi 等的结果表明仅有一部分 NSCLC 患者对靶向药物治疗有反应，可能与 EGFR 和 / 或 k-ras 基因突变有关。因此对晚期 NSCLC 患者检测 EGFR 基因突变，可能有助于选择适当的患者并对疗效进行分子预测。 ② 使用单克隆抗体，如 C225 (Cetuximab) ，它可与 EGFR 细胞外结构域相结合，阻止受体二聚体的形成 , 使酪氨酸激酶不能被激活。有学者报道， C225 能增加化疗药物的疗效。单独使用 C225 治疗 NSCLC 的 Ⅱ 期临床研究则正在进行中。其他还有使用重组 EGF 疫苗 EGF2P64K 、反义寡核苷酸 AS221 等 EGFR 靶向治疗方案，都在进行相应的 Ⅱ 期和前期的临床研究。

四、相关基因表达的异常

（一） β- 微管基因突变及 β 微管蛋白同型表达的改变与耐药

微管蛋白分为 α 、 β 两个亚型，为细胞骨架的重要组成部分，它担任着维持细胞形态、进行物质交换、传递信息、参与有丝分裂等的重要功能。紫杉类药物的作用机制主要通过干扰微管系统，阻止细胞的有丝分裂来发挥其细胞毒性作用。紫杉醇通过作用于 β 微管蛋白 N 端第 31 个氨基酸上，此位点由外显子 1 和 2 编码，在种属间高度保守。许多研究表明 β 微管蛋白同型表达的改变可以引起紫杉醇的耐药，在人类细胞中存在着 6 种 β 微管蛋白同型，这些同型具有各自独特的动力学特性并且在体外与紫杉醇存在着不同的相互作用。 NSCLC 细胞系 A549-T12 和 A549-T24 对紫杉醇的耐药性分别增加了 9 倍和 17 倍， RT-PCR 分析表明， A549-T12 和 A549-T24 分别和敏感细胞系 A549 比较， Ⅲ 和 Ⅳa 型 β 微管蛋白同型分别在 A549-T12 和 A549-T24 细胞中增加 2 ～ 3 倍和 4 倍。 Kavallaris 等用反义寡核苷酸技术发现 Ⅲ 型 RNA 下降 40% ～ 50% 时，伴随 Ⅲ 型 β 微管蛋白水平下降，从而导致对紫杉醇的敏感性提高了 39% 。因此， Ⅲ 型同型 β 微管蛋白的表达增加可能阻碍紫杉醇稳定微管的效果。综上结果， Ⅲ 型 β 微管蛋白同型的表达水平可能是肿瘤细胞对紫杉醇敏感性的决定因素。

Rosell 等在研究中发现 , 影响紫杉醇活性的微管突变率为 20% ，且突变主要在 102 ～ 264 密码子周围，这一密码子与 GTP 和紫杉醇 β- 微管结合点关系密切。他们研究了在 131 例 NSCLC 患者血清中 β- 微管基因突变的情况，发现有 42% 的患者该基因突变，而健康对照组无一例阳性。在这组阳性的病人中无一例对紫杉醇治疗有效。 Monoz 等为明确 β- 微管蛋白基因突变与紫杉醇耐药的相关性，研究了 49 例紫杉醇化疗后的 NSCLC 患者的活检标本，发现 16 例存在 β- 微管蛋白基因突变，同样也无 1 例对化疗有效。在 33 例没有 β- 微管蛋白基因突变的病人中 13 例获得完全或部分缓解。由此可推测， β- 微管蛋白基因突变可以作为一个重要的耐药分子指标。

（二） UGT1 基因的多态性与耐药

UGT1 基因编码多种形式的 UDP- 葡萄糖醛基转移酶，该酶参与伊立替康（ irinotecan ）的代谢。 Font 等的研究分析了接受泰索帝 / 伊立替康二线化疗的 NSCLC 患者中 UGT1A1 基因的多态性，依据其启动区域的重复序列的不同（ 6/6 ， 6/7 ， 7/7 ）而分为不同的组，发现 6/6 组患者的客观缓解率（ PR+SD ）为 26% ，而 6/7 、 7/7 组患者则为 45% ，两组的 1 年生存率分别为 17% 和 58% ，其结果提示 UGT1A1 基因的多态性可能与 NSCLC 患者对伊立替康化疗的疗效有关。

以上为近年来肺癌个体化治疗的研究热点，这些研究探索使我们有理由相信在不远的未来，指导临床实践而又实用的 “ 个体化 ” 化疗或靶向治疗基因 / 蛋白芯片检测盒将进入实用阶段，针对每一位个体肺癌患者，肿瘤学家和临床医师能够根据 “ 个体化 ” 检测盒，筛选化疗或靶向治疗的获益人群，治疗后评估、检测、优化治疗，使多数肺癌患者能够通过筛选进入治疗获益人群，最大限度的避免无效治疗，这种获益人群的治疗优势组合，将最大限度的提高肺癌的长期生存率，使晚期肺癌转变为 “ 慢性病 ” 治疗成为可能。

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