肿瘤新生血管的分子靶向治疗进展
第二军医大学长征医院 王杰军
1971 年，肿瘤血管形成研究的先驱 —— 美国波士顿儿童医院的 Judah Folkman 博士 —— 在《新英格兰医学杂志》中首次提出 “ 肿瘤生长依赖于血管生成（ tumor angiogenesis ） ” 的概念。 其后，他又证实肿瘤初期生长不伴有新血管生成，但到肿瘤生长至 l ～ 2mm 后，若要继续增长的话就必须靠新血管生成来维持。 实体肿瘤在小于 1 ～ 2mm 3 时可以没有血管，在没有血管形成的情况下，肿瘤的营养供给及代谢物排泄靠简单的物理弥散就可以完成此时肿瘤组织的生长极缓慢或处于 “ 休眠 ” 状态，称为血管前期。肿瘤的进一步增长必须有新生血管形成，新生血管通过灌注形式为肿瘤细胞生长提供营养供给，同时它也是肿瘤细胞代谢产物排泄的有效途径。 此外，肿瘤通过血液循环将癌细胞输送至转移靶器官。因此，血管新生是肿瘤生长、发展的必经之路，与实体瘤的发生、转移有着密切的关系。
一、肿瘤生长依赖新生血管的依据
1945 年，在研究创伤及肿瘤对血管的影响时，发现了如下的现象：将含肿瘤细胞的半透膜小室埋在小鼠皮下，结果发现小室内的肿瘤细胞在新生血管形成前生长缓慢，而当小室内有新生血管形成后，肿瘤细胞生长迅速加快；同时也发现在小室的半透膜面，新生血管形成丰富，提示新生血管形成对肿瘤生长有利，而肿瘤细胞本身具有诱导新生血管形成的作用。
鸡胚尿囊膜模型研究证明，在无血管期肿瘤生长通常受到明显的限制，肿瘤的直径多在 0.93±0.29mm ；进入血管期后，肿瘤在血管形成的 24 小时内迅速增长，在 7 天左右直径达到 8.0±2.5mm 。尿囊膜通常发生在鸡胚发育的第 5 天，其血管内皮细胞 H-TdR 的掺入值，随着时间的推移逐步降低，在第 8 天时急速下降。按时间顺序连续在尿囊膜上移植肿瘤发现，随着时间推移，血管内皮细胞的生长速率在下降，血管形成在减少，甚至血管萎缩，肿瘤的生长亦与之相应的降低。
1989 年 Folkman 等在《自然》杂志上发表转基因小鼠的实验结果。在鼠胰腺 β 细胞中转入 SV40 T oncoprotein 基因后， β- 细胞在 4~6 周时，即出现增生现象， 9.5 周时约 50% 的胰岛出现增生的 β- 细胞；但仅有一小部发生癌变。通过体内外的研究发现，能引起新生血管形成的增生细胞与肿瘤的发生之间有着密切的关系；而良性增生往往不伴有诱生新生血管的能力。提示血管形成在肿瘤的发生过程中有重要的作用。
以上的研究都证明，肿瘤与血管形成之间有着密切的关系。虽然未能直接地证明肿瘤的生长是依赖血管形成的，但是间接地提示了这一现象中的一种必然联系的存在。
从 20 世纪 80 年代末开始，人们开始找到许多更加直接的证据表明肿瘤的生长是依赖血管的。
1993 年 Kim 等发表的裸鼠研究结果证明，有三株人肿瘤细胞生长是依赖于血管内皮细胞生长因子（ VEGF ）对新生血管形成的促进作用，应用抗 VEGF 的抗体肿瘤的生长则受到抑制。
Gross 及 Hori 等分别报告，腹腔内注射碱性纤维母细胞生长因子（ bFGF ）后可以刺激原发肿瘤的生长及转移；而使抗 bFGF 的特异性抗体后，可以抑制 70% 对 bFGF 刺激的血管形成依赖的肿瘤的生成。
二、肿瘤转移与新生血管的关系
上述研究从直接及间接的方面证明了血管形成在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，大量的实验也证实肿瘤血管形成与肿瘤转移及患者预后密切相关。
1992 年， Macchiarini 报道了肺癌中血管形成研究的结果，对 87 例 T 1 N 0 M 0 的 NSCLC 患者术后计数肿瘤平均血管密度及数量，发现微血管密度和转移的发生明显相关。在放大 200 倍的显微镜下，微血管数为 0 ～ 9/HP 时，肿瘤转移发生率为 9.2 ％； 10 ～ 19/HP 时，为 62 ％； 20 ～ 30/HP 时为 100 ％。如果以 0 ～ 9/HP 者发生转移的相对危险度为 1 ，那么， 10 ～ 19/HP 者则为 2.42 ； 20 ～ 30/HP 者则为 20 。
Giampietro 研究了乳腺癌患者肿瘤组织中血管密度与预后的关系，发现乳腺癌患者的死亡率及复发率与微血管密度呈正比。血管密度超过 100/HP 者，有 39 ％复发，其中 20.7 ％的患者死亡；相反，微血管密度低于 33/HP 者仅 4 ％复发及死亡。
Saclarides 研究大肠癌患者肿瘤组织中血管密度与预后的关系发现，血管密度状况和在病变穿透粘膜的患者 5 年死亡率明显增高（ P ＝ 0.002 及 P ＝ 0.013 ）；同时还发现血管密度中每增加 10 ，复发率则增加 2.7 倍。
还有多项研究证明血管密度与鼻咽癌，卵巢癌，胰腺癌、肾细胞癌、前列腺癌，膀胱癌、胃癌等肿瘤的转移及预后之间有着密切的相关性。 大量的研究表明肿瘤组织内微血管密度 (micro-vessel density ， MVD) 越高，临床预后越差。因此研究者们认为肿瘤内新生血管的形成影响着肿瘤患者的临床预后。
三、肿瘤新生血管与相关因子
迅速生长的肿瘤组织中的微血管表现出一系列结构异常：结构紊乱、内皮不完整、血管扭曲、盲端和动静脉吻合。由于血管通透性高，缺乏引流多余液体的淋巴网络，新生毛细血管间质液压很高，该高压是抗癌药物通过的障碍，却有利于肿瘤细胞的扩散和转移。供氧不足不但是实体瘤的特征，其本身也是血管新生的刺激因素。
进一步的研究发现血管生成是由肿瘤血管生成因子 ( 正调 ) 及抗肿瘤血管生成因子 ( 负调 ) 共同调控的。已知的促血管新生和生长的因子包括血管内皮生长因子家族 VEGF 、 TGF 、表皮细胞生长因子 (EGF) 、 TNF 、 FGF 、 PDGF ，胰岛素样生长因子 (IGF) 、血管生成素、血管趋向素 (angiotropin) 、 IL-8 、多育曲酶素 (proliterin) 、神经节苷脂、 SPARC 等。其中最重要和研究最多的是 VEGF ， VEGF 是由低氧和低血糖诱导，并且与两个酪氨酸激酶家族的特异性受体 (KDR) 和 (FIT-1) 结合，两个受体对内皮细胞具有正向调节作用。其他研究较多的血管生长因子还有 PDGF 、 FGF 、 EGF 、 TGF 、 TNF 等。抑制血管生成的因子按其作用及功能分为：（ 1 ） a 趋化因子，如 PF-4 、丫 -IFN 、诱导蛋白 -10(IP-10) 等；（ 2 ）蛋白质降解产物，如血管抑素、内皮抑素、泌乳素及层粘蛋白降解产物及片段等；（ 3 ）具有血管生成促进和抑制双重作用的因子，如血小板反应素 -l ；（ 4 ）其他类，如 TIMP 、可溶性 FGF 受体、血小板敏感蛋白 (TSP) 等；另外还有与血管生成调控相关的癌基因 ( 如 src 、 sis 、 ras 、 iun) 、抑癌基因 ( 如 p53) 及其产物。
关于肿瘤血管生成的发生有 2 种解释：一是血管新生的活性采源于肿瘤细胞自身分泌的活性物质 --- 肿瘤血管生成因子；二是来源于肿瘤组织周围的宿主细胞，或由细胞外基质启动，或伴发内皮细胞增殖抑制能力的丢失。基于以上理论， Folkman 提出肿瘤的血管生成依赖于肿瘤血管生成刺激剂和肿瘤血管生成抑制剂的不平衡，而这些活性物质或来自于肿瘤细胞或来源于某种宿主细胞，故肿瘤血管生成受多种细胞的调控和影响，除肿瘤细胞和血管内皮细胞外，还包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞、结缔组织细胞等。这些细胞如何被激活和释放细胞因子的机制尚不清楚，但缺氧是最主要的原因，肿瘤细胞的快速增殖导致其缺氧，缺氧可诱导多种促血管内皮细胞生长因子的分泌已被证实。此外，细胞外基质中肝素、血栓素以及蛋白质的裂解产物亦可导致其他促血管生成因子的释放。
（一）血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 和血小板源性生长因子 (PDGF)
VEGF 是一个热、酸稳定的分子，分子量为 34×10 3 ～ 45×l0 3 u ，序列高度保守，其脂蛋白单体以二硫键结合成二聚体而具有生物活性。 VEGF mRNAs 共有 5 种，分别编码不同的 VEGF 亚型，它们分别是 VEGF121 、 VEGF145 、 VEGF 165 、 VEGF189 和 VEGF206 ，多数组织以 VEGF165 表达为主。含 8 个外显子的 VEGF 基因经转录和剪切后表达成不同分子量的 VEGF ， 5 种类型的 VEGF 具有相同的生物活性。 VEGF 是一种外分泌蛋白，其中 VEGF165 和 VEGF121 以可溶性方式分泌， VEGFl89 和 VEGF206 以与细胞表面蛋白多糖结合的形式存在，是与胞外基质紧密结合的不溶性蛋白。 VEGF 选择性直接作用于血管内皮细胞膜上的 3 种 III 型酪氨酸激酶受体 (VEGFR-1 ／ Flt-1 、 VEGFR-2 ／ KDR ／ Flk-1 和 VEGFR3/Flt-4) 。 KDR 是血管形成的主要调控分子，具有明显的化学趋化和促分裂作用，与血管岛、血管形成和造血有关；而 F1tl 主要在内皮细胞排列形成管腔时发挥作用， VEGF 及其受体通过这种旁分泌途径联合调控内皮细胞分化、血管形成。因这两种受体主要表达在内皮细胞上，而极少数细胞的造血细胞、单核细胞也有少量表达，但只有内皮细胞对 VEGF 有应答反应，故 VEGF 是一个特异作用于血管内皮细胞的生长因子。 VEGF 与受体结合后细胞内 ca2+ 浓度急骤升高达 4 倍以上，这是目前检测 VEGF 活性最敏感的方法之一。已知 VEGFl21 和 VEGF165 促血管内皮细胞分裂、增殖的作用机制主要是通过刺激磷脂酶 c 的活性，水解磷酸肌醇使胞内第二信使 IP3 增加而实现其功能。 VEGF 家族目前主要包括 VEGF （ VEGF-A ）、胎盘生长因子、 VEGF-B 、 VEGF-C 、 VEGF-D 和 VEGF-E 。其中 VEGF 是诱导肿瘤血管形成作用最强、特异性最高的血管生长因子。 Tkhashi 等应用免疫组化方法研究显示，在肺癌等多种实体瘤 ( 如消化系统、神经系统、泌尿、生殖系统肿瘤 ) 组织中均有 VEGF 及其受体的表达，且与肿瘤血管计数有关，可作为癌转移的临床监测指标。 VEGF 抗体、 VEGF 反义核酸及突变型 VEGFR 基因可用于抗肺癌及其他实体瘤的血管形成治疗， VEGF 是抗肿瘤血管形成治疗和抗肿瘤转移治疗较为理想的靶分子。
PDGF 的氨基酸结构与 VEGF 相似，因 PDGF 基因结构 (A ， B 链 ) 与 VEGF 基因结构相似，约存在 33 ％的同源性，故其理化性质亦类似 VEGF 。 PDGF 羧基端有赖氨酸和精氨酸密集区使其靶细胞特异性及生物学特异性不同于 VEGF 。 PDGF 可由肿瘤细胞、巨噬细胞、血小板细胞等表达分泌，包括 PDGF-A 和 PDGF-B ，此外还有集落刺激因子 1 受体（ Colony stimulating factor-1 receptor, CSF-1R ）、干细胞生长因子受体（ Stem cell factor receptor, SCFR/KIT ）、 FLK2/FLT3 。 PDCF-B 受体表达于胎盘毛细血管细胞，可直接诱导血管内皮细胞增生，当新生血管管腔形成后， PDGF 受体立即下调。 PDGF 不仅作用于血管内皮细胞，还具有刺激中胚层来源的纤维母细胞和平滑肌细胞增殖的作用。
血小板源内皮细胞生长因子 (PD-ECGF) ，是一个 45×10 3 u 的单链多肽，与 VEGF 和 FGF 不同， PD-ECGF 不与肝素结合，肝素亦不能增强其效应， PD-ECGF cDNA 与 FGF 相似，缺少信号肽顺序。某些癌细胞可产生 PD-ECGF ，但不能分泌之，而将其储备于细胞内，作用机制尚不清楚。 PD-ECGF 是内皮细胞特异的有丝分裂素，能刺激内皮细胞增生，但对纤维细胞无此作用。研究表明 PD—ECGFcDNA 转染肿瘤细胞，其裸鼠移植瘤血管密度明显增加。
（二）转化生长因子 (TGF) 和表皮细胞生长因子 (EGF)
TGF 是一类具有转化作用的生长因子，具有刺激细胞从贴壁依赖性生长转变为贴壁非依赖性生长的作用，最早由 Delarco 和 Todoro 从鼠肉瘤病毒转化的 3T3 细胞无血清培养液中分离得到。 TGF 分 5 类，研究较多的是 TGF-a 和 TGF-β 。 TGF-a 是分子量为 5.6×103u 的单链多肽，与 EGF 有 40 ％同源性，可与 EGF 竞争结合列共同的细胞表面受体 EGF—R 上。 1984 年 Derynck 首先克隆出人 TGF-a cDNA ，并在大肠杆菌中表达了有活性的 TGF-a 多肽，其广泛分布于肿瘤细胞、转化细胞、纤维细胞和胚胎组织细胞。 TGF-a 与 EGF 能有效结合肿瘤细胞及血管内皮细胞的 EGF 受体 (EGFR) ，并导致受体相关的酪氨酸酶活化，促细胞分裂、增殖和转化，刺激血管形成，促进肿瘤生长。 TGF-β 分子的组成、结构和受体明显不同于 TGF-a, 常被描述为一种负性生长调节因子，而实际上它是个双向作用因子，既可诱导某些肿瘤细胞增生，也可抑制另一些肿瘤细胞增生；对大血管内皮细胞具有抑制作用，而对小血管内皮细胞具有促生长作用。成熟、有活性的 TGF-β 其分子量为 25X103u ，是一个二聚体分子，比较稳定。人 TGF-β cDNA 于 1985 年被克隆出来， TGF-β 存在于多种正常成体细胞、造血细胞、胚胎细胞和肿瘤细胞中，其作用是促细胞转化、增殖、分化，其促增殖作用主要通过诱导细胞 c-sis 基因编码的 PDGF-β 起作用。因其在上皮细胞无 PDGF 受体，所以 TGF-β 对多种类型上皮细胞及其所发生的肿瘤表现为抑制作用，如 TGF-β1 通过 Rb 基因下调 c-myc ，同时 TGF-β1 在 G1 期直接阻止 Rb 磷酸化而抑制细胞增殖，并可诱导细胞凋亡，故 TGP-β 的高表达是细胞发生凋亡的一个标志。另外， TGF-β 是很强的免疫抑制剂，抑制淋巴系统的细胞增殖作用与其能拮抗其他生长因子如 TGF-a,EGF ， FGF 及 IL-2 等有关。人非小细胞肺癌可自分泌 TGF-a 或 TGF-β ，并受两种正、负生长因子的调控，早期肺癌或癌旁组织中即可观察到 TGF-a 和 EGF-R 过量表达，有助于癌变早期诊断，而转化的支气管上皮细胞亦可见 TGF － 9 高表达。 TGF-a 和 TGF-β 正负调控肿瘤血管内皮细胞生长的作用，可将其应用于抗肿瘤血管治疗。
（三）肿瘤坏死因子 (TNF)
TNF 有 2 类： TNF-a 和 TNF-β 。 1984 年 Penmica 等首次分离、鉴定了人 TNF-a cDNA ，同年， Grayp 等又分离鉴定了人 TNF-βcDNA ，其基因均位于人 6 号染色体。 TNF-a 和 TNF-β 分子的氨基酸有 28 ％同源。 TNF-a 分子有 2 种形式，一种是 26×103u 的膜结合型蛋白。另一种是 17X103u 的分泌型蛋白，两者在体内外均具有细胞毒作用。 TNF 分子中单个氨基酸的改变即对其生物学特性产生很大影响。 TNF 受体 (TNFR) 存在于多种正常细胞及肿瘤细胞表面， TNF 与其相应的 TNFR 结合后通过介导复杂的信号传导而表现其生物学活性。 TNFR 有两种类别，分别为 TNFR-p55 主要存在于对 TNF 细胞毒活性敏感的细胞上，而 TNF-p75 主要存在于骨髓来源的细胞及经过刺激的 T 细胞和 B 细胞上，前者介导 TNF 的抗肿瘤细胞毒活性，而后者介导 TNF 在抗肿瘤治疗中的毒性不良反应。 TNF 在肿瘤血管生成中的作用主要是抑制人血管内皮细胞的生长，作为细胞趋化因子诱导其他细胞分泌促血管生长因子，同时又与其他血管生长因子协同作用，导致新生血管管腔形成。
（四）成纤维细胞生长因子 (FGF)
FGF 是在脑和垂体的提取物中发现的一种促成纤维细胞生长的物质， 1975 年定名为 FGF 。并初步确定了其理化性质。根据 FGF 等电点不同可分为酸性 (aFGF) 和碱性 (bFGF ) 两种，两者不是同一基因的产物，分别位于人第 4 ， 5 号染色休，但其氨基酸有 55 ％同源性，都为单链结构。 bFGF 是第 — 个被证实的促血管生长因子，可由多种内皮细胞表达，包括平滑肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞及肿瘤细胞等， FGF 不存在或以极低浓度存在于血清和体液中，主要结合在血管基底膜上，因基底膜具有肝素样物质， FGF 结合在肝素化硫酸蛋白上，并储存于细胞外基质中，通过肝素替换或蛋白酶的裂解作用释放出来，发挥其血管形成作用。 FGF 作为细胞分裂原主要作用于内皮细胞、平滑肌细胞、骨细胞及成纤维细胞等，即其受体广泛分布于上述细胞表面， bFGF 和 aFGF 具有同一受体，但 bFGF 与受体亲和力大于 aFGF 。
FGF 对内皮细胞是一种强趋化因素，刺激内皮细胞产生胶原酶、激活血纤维蛋白溶酶激活因子，这些都促使基底膜降解，诱导内皮细胞迁移，形成像毛细血管样的小管腔，故 FGF 在肿瘤血管形成中起生要作用。
（五）癌基因和抑癌基因
原癌基因 c-erbB-2 产物 perbB-2 与 EGFR 同属 I 型生长因子受体家族，两者在氨基酸序列上有 50 ％同源，胞内区均具有酪氨酸激酶 (TPK) 活性，通过自身磷酸化后激活细胞内的磷脂酶 C 、磷脂酰肌醇激酶和 p21rasGTP 酶激活蛋白 (rasGAP) 改变细胞代谢，发挥 EGFR 样促血管生成的作用；同样，原癌基因 ras 及其产物 p21ras 参与或通过上述途径调节血管生成。 sis 基因家族的另一成员 sis 基因，其产物 p28v—sis 与血．小板衍生生长 PDCF 有高度同源性，可与 PDGF 受体相结合激活酪氨酸蛋白激酶发挥类似作用，调节细胞分裂、增殖及分化，促血管形成。 src 基因在低氧情况下被激活，可通过诱导 VEGF 表达参与肿瘤血管形成。核内原癌基因 c-ets 存在于血管形成开始时的内皮细胞，编码的蛋白质能特异性连接于某段 DNA 特定部位，此段基因负责调节胶原酶和尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂以及在细胞外基质降解过程中所需的蛋白酶的合成，这些合成产物均为血管形成过程中内皮细胞的游走所必需。其他的核内原癌基因如 c-jun 、 c-fos 、 c-myc 等及 Int-2 、 hst 、 k-fgf 基因亦参与细胞分裂、增殖及分化的调控，在肿瘤血管生成中发挥调节作用。抑癌基因 p53 在细胞周期调控中发挥调控细胞增殖、分化和凋亡的重要作用，研究表明：突变型 p53 基因与蛋白激酶 C(PKC) 共同诱导 VEGF 表达， p53 基因突变的细胞有 VEGF 的高表达。而野生型 p53 基因可抑制 VEGF 表达，并可与 TGF-β 协同诱导肿瘤细胞及血管内皮细胞凋亡，此外它亦可通过调控抗血管生成因子如 TSP 抑制肿瘤血管生成。 TSP 是生理性的血管生成抑制剂，有 5 种不同类型，其中 TSP1 受 p53 调控， TSP1 和 p53 的表达与肿瘤 MVD 、肿瘤复发和转移呈负相关。 Rb 、 P16 等抑癌基因亦可通过细胞周期调控影响肿瘤血管生成。
（六）血管抑素和内皮抑素
血管抑素及内皮抑素是高效、特异的血管抑制因子，是一种内生性蛋白质，能特异性抑制血管内皮细胞生长，其来源于纤维蛋白溶酶原 (plasminogen) 的裂解片段， plasminogen 及其激活因子和激活抑制因子与内皮细胞组合的复合体共同构成血管生成的负性调节因子，主要是抑制血管内皮细胞增殖而抑制血管生成。 97 年由美国哈佛医学院的 O`Reilly 和 Folkman 等在培养的鼠内皮细胞瘤 (EOMA) 细胞培养液中发现的，序列分析显示其为胶原蛋白 18C 末端片段。内皮抑素的生物学功能包括抑制内皮细胞增殖，抑制体血管生成及抗动物肿瘤转移等。
四、针对肿瘤新生血管的分子靶向治疗
虽然目前仍未完全清楚肿瘤新生血管生成机制，但临床的研究证明抗血管形成的治疗是肿瘤治疗的一个新的途径，并且在临床上取得了一定的效果。抗肿瘤新生血管的靶向治疗与传统化疗和放疗相比有以下优点：（ 1 ）靶向明确，对正常组织损伤较小；（ 2 ）不易产生耐药性；（ 3 ）肿瘤血管内皮细胞的有限损伤就可造成大量肿瘤细胞的生长抑制，不会对骨髓和造血器官产生毒性；（ 4 ）抗血管生成治疗可应用到多种恶性肿瘤，具有广谱性。
Genentech 公司开发的人源抗 VEGF 单抗 Bevacizumab 可以直接封闭 VEGF ，是一种广谱的抗肿瘤药物。 AvastinⅢ 期随机、双盲对照试验对 Avastin 一线治疗结直癌的疗效及安全性进行了研究。共有未经过治疗的 925 例转移性结直肠癌患者参加。观察的一级终点为总生存期，二级终点为无进展生存期、总体反应率和反应持续时间。患者被随机分配至三个治疗组，组 1 （ n=412 ）接受 IFL ＋安慰剂（依立替康、 5 －氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸每 4 周给药一次， 6 周为一疗程，安慰剂每 2 周给药一次，直至疾病进展）；组 2 （ n=403 ）接受 IFL ＋ Avastin （ IFL 每四周给药一次， 6 周为一疗程， Avastin 5mg/kg 每 2 周一次静脉注射给药直至疾病进展）；组 3 （ n=110 ）接受 FL ＋ Avastin （ 5- 氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸每 6 周给药一次， 8 周为一疗程， Avastin 每 2 周给药直至疾病进展）。 Avastin 联合 IFL 较单用 IFL 相比，能使中位总生存期延长 4.7 个月（ 30% ）（分别为 20.3 个月 和 15.6 个月， P <0.001 ）；中位无进展生存期延长 4.4 个月（ 66% ）（分别为 10.6 个月和 6.2 个月， P <0.001 ）。 Kaplan-Meier 曲线显示在治疗早期即可观察到 Avastin 的临床益处，并贯穿整个疗程。 IFL ＋安慰剂组的总体反应率为 34.8% ，反应持续时间为 7.1 个月；而 IFL ＋ Avastin 的总体反应率为 44.8% ，反应持续时间为 10.4 个月。组 3 中 FL ＋ Avastin 的中位总生存期为 18.3 个月。另一项 Avastin 联合 5 － FU/LV 一线治疗转移性结直肠癌 Ⅱ 期试验 2 共有 71 例转移性结直肠癌患者参加， 5 － FU/LV 组 36 例， Avastin (5mg/kg)+5-FU/LV 组 35 例。结果显示，化疗方案与 Avastin 联合作为结直肠癌一线治疗能使中位总生存期延长 4.1 个月（分别为 17.7 和 13.6 个月）。 1032 例患者中（其中转移性结直肠癌患者 568 例，其他肿瘤患者 464 例）对使用 Avastin 的安全性进行了评价，其中最严重的不良反应胃肠道穿孔、伤口裂开和出血（胃肠道出血、蛛网膜下腔出血和出血性休克），其他不良反应有高血压、肾病综合症和充血性心力衰竭。在 Ⅲ 期临床试验中，穿孔在 Avastin ＋ IFL 组的发生率为 2% （ 6/392 ）、在 Avastin+FL 组的发生率为 4% （ 4/109 ）、 IFL 组为 0.3 （ 1/396 ），典型症状为腹痛伴有便秘、恶心和呕吐。鉴于上述 2 项试验结果， Avastin 于 2004 年 2 月被美国 FDA 批准应用于临床，成为首个被批准用于临床的血管生长抑制剂。由于这种抑制血管生长的抗肿瘤机制可能涉及多种恶性肿瘤，罗氏与基因技术公司正在研究 Avastin 对其他癌症的潜在临床益处，包括非小细胞肺癌、胰腺癌、乳腺癌和肾细胞癌等。对非转移性结直肠癌患者的大型临床研究也正在进行之中。
Novartis 公司研发的 PTK787/ZK22584 是一种口服的多靶点 VEGF-R 抑制剂，其抑制的靶点包括 VEGF-R1 、 VEGF-R2 和 VEGF-R3 。由于 VEGF-R3 与淋巴管形成有着密切关系，因此 PTK787 可以在理论上抑制肿瘤新生淋巴管形成。 Ⅲ 期 CONFIRM-1 试验对 PTK787 一线治疗中晚期结直癌的疗效及安全性进行了研究。共有未经过治疗的 1168 例转移性结直肠癌患者参加。观察的一级终点为总生存期和无进展生存期，二级观察终点为总体反应率。患者被随机分入治疗组或对照组。共 583 名患者进入组 1 ，接受 FOLFOX4+ 安慰剂的治疗，另外 585 名患者进入组 2 ，接受 FOLFOX4+PTK787 1250mg 口服 1/ 日治疗。结果显示 FOLFOX4 组无病生存期为 7.6 个月， FOLFOX4+PTK787 组无病生存期为 7.7 个月，未看到两组之间的统计学差异。在 CONFIRM-1 试验中，发现 LDH 可以作为一项提示预后的指标。最终的结果预计将在 2006 年中旬发表。 CONFIRM-2 试验将 PTK787 作为二线药物应用于既往经过 5-FU 和 CPT-11 而出现疾病进展的患者。试验采用和 CONFIRM-1 相同的设计分组。中期分析以新闻简报的形式发表，目前未看到试验组和对照组之间的总体生存期上的统计学差异。但是 LDH 作为一项提示预后的指标，在 CONFIRM-2 中显示了和 CONFEIRM-1 中相似的作用。
Bayer 公司研发的 Bay 43-9006/Sorafenib 是新型的口服多靶点抗肿瘤药物，它的作用靶点更加广泛，已知的作用靶点包括 VEGFR-2 、 VEGFR-3 、 PDGFR-b 、 RAF/MEK/ERK 、 KIT 、 FLT-3 和 RET ，因此 Bay 43-9006 可以同时抑制肿瘤新生血管生成、肿瘤新生淋巴管生成和肿瘤细胞繁殖。一项 Ⅲ 期试验采用 BAY43-9006 对既往治疗失败的不可切除或转移性肾脏透明细胞癌患者进行治疗。共 905 名患者纳入该试验。进入试验的患者被随机分为 2 组：组 1 口服 BAY43-9006 400mg 2/ 日治疗，对照组采用安慰剂。主要观察终点为总体生存期，次要观察终点包括无进展生存期、总反应率和生活质量。到目前为止， BAY43-9006 组中位无进展生存期为 24 周，安慰剂组中位无进展生存期为 12 周。 BAY43-9006 组疾病进展率 9 ％，安慰剂组疾病进展率 30 ％。 768 例患者（ BAY43-9006 组 384 例、安慰剂组 384 例）进行了安全性评价，血液学毒性包括粒细胞降低（ BAY43-9006 组 5 ％、安慰剂组 2 ％）、贫血（ BAY43-9006 组 1% 、安慰剂组 3 ％），非血液学毒性包括手足综合征（ BAY43-9006 组 5 ％、安慰剂组 0 ％）、疲劳（ BAY43-9006 组 2 ％、安慰剂组 1 ％）、高血压（ BAY43-9006 组 1 ％、安慰剂组 0 ％）、皮疹（ BAY43-9006 组 1 ％、安慰剂组小于 1 ％）。试验提示 BAY43-9006 治疗晚期肾癌的有效性和安全性令人满意。鉴于上述研究结果，欧洲已将 BAY 43-9006 批准作为晚期肾癌的治疗药物。并且已经获得 FDA 的批准。正在开展的研究包括 BAY43-9006 治疗恶性黑色素瘤、原发性肝癌的 Ⅲ 期试验，期待获得良好的治疗结果。
进入临床研究的 VEGFR 受体酪氨酸激酶抑制剂还包括 SU11248 、 AZD6474 、 AZD2171 。 SU11248 是 Sugen 公司研发的小分子抑制剂，选择性作用于 PDGFR/VEGFR/KIT/FLT3 ，是一种口服的多靶点抗血管形成和肿瘤增殖药物，在 Imatinib 治疗失败的 GIST 患者和转移性肾癌患者中已经显示出治疗效应。 ZD6474 和 ZD2171 都是 AstraZeneca 公司研发的 VEGFR 的抑制剂。 ZD6474 是 VEGFR/EGFR/RET 的选择性抑制剂，属喹唑啉类化合物，目前针对髓甲状腺癌抗肿瘤活性和安全性的 Ⅱ 期临床试验正在进行中，由于 RET 在髓甲状腺癌中的特殊意义，欧洲罕见药品委员会和 FDA 已经将其初步准备批准推荐用于髓甲状腺癌的治疗，最终决定将于 2006 年公布。
TNP-470 （烟曲霉素衍生物）是烟曲霉素 (fumagillin) 的半合成类似物，抑制内皮细胞的增殖、游走及血管形成的作用较后者更强，毒性也低。该药与吉西他滨或顺铂联合使用， Ⅲ 期临床用于宫颈癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等实体瘤治疗显示出了明显的抗肿瘤活性。内皮抑素（ endostatin ）都对肿瘤新生血管生成有强烈抑制作用，且没有发现耐药现象。国内研发的药物研究顺利完成了临床研究，并已经上市。临床研究中显示该药物与化疗联合可以明显地增加对非小细胞肺癌地疗效。 肿瘤抗新生血管生成治疗面临的问题和展望
肿瘤新生血管研究进展迅速，可是在抗肿瘤血管生成药物临床试验中遇到了几个问题，主要有以下几个方面：
（ 1 ）临床试验的最佳剂量和用药时间：新生血管治疗是一个长期、慢性的治疗过程，临床研究发现 endostatin 低剂量、持续给药比大剂量给药效果更好。不同的肿瘤对于给药剂量会产生不同的反应，如进入 Ⅱ/Ⅲ 期临床试验的 VEGF 单抗 Bevacizumab 治疗晚期直肠癌时，使用 5mg/kg 剂量时对 40% 病人有效，而使用 10mg/kg 剂量时只对 24% 病人有效；当用它治疗非小细胞肺癌时 15mg/kg 剂量比 7.5mg/kg 更有效。
（ 2 ）动物试验与临床试验的差异：如 SU5416 在动物试验和早期临床试验效果很好，当进入 Ⅲ 期临床试验时效果很差； angiostatin 和 endostatin 也一样，动物试验表明它们对肿瘤新生血管生成有强烈抑制作用，但后期临床试验都失败了。
（ 3 ）抗血管生成治疗如何与化疗、放疗及其他生物治疗进行有效结合：在动物模型试验中显示微血管内皮细胞是放疗作用的首要靶点，有研究表明如果放疗前先用 angiostatin 处理，放疗靶向损伤微血管内皮细胞作用将比单一的放疗效果更好。
（ 4 ）毒副作用：抗血管药物毒副作用主要表现为：形成血栓、出血、生殖 / 排卵 / 妊娠功能障碍、伤口愈合延迟等其他多种毒副作用。例如， SU5416 在临床试验过程中发现 19 个病人中有 8 个产生血栓反应； Iressa 在治疗非小细胞肺癌 Ⅱ 期临床试验中，疗效很好，但在美国有 0.3% 的病人合并严重的肺部疾病，其中大约 1/3 的病人因此死亡，而在日本有 2% 的病人合并严重的肺部疾病。
（ 5 ）微血管的标记和计数：在肿瘤血管生成研究中的结果差异，可能涉及到病理的筛选、样本的大小、随访时间的长短等因素，其中微血管的标记和计数最为重要，因此，在肿瘤血管生成研究中对微血管的标记和计数的全过程应采用规范、标准、客观的方法，只有这样才能得到可靠的数据资料和客观合理的结论。
（ 6 ）寻找新的内皮细胞标记物：新的内皮细胞标记物的发现对抗血管靶向治疗具有重要作用，目前主要技术有 Microarray 、 SAGE 、 phage display 、 proteomics 、 function genomic methods 、 cDNA library 、 peptide library 等技术。
